人红细胞的平均寿命为100~120天,正常人体内大约存在3×1013个红细胞。每天,有超过2×1011个红细胞被替换。红细胞在体内经历成熟、衰老,最终被脾、肝、骨髓等处的巨噬细胞吞噬、分解。而且老化或者疾病的红细胞往往呈现较弱的细胞形变以及形变恢复能力,使之易于被脾脏滞留,从而被吞噬细胞吞噬以及消化。巨噬细胞对凋亡细胞的识别主要通过其表面的受体来进行的。成熟哺乳动物的红细胞没有细胞核以及细胞器等,红细胞膜的异常(如带3蛋白交联,锚蛋白外翻)触发了巨噬细胞表面的受体分子与其识别,接着黏附、吞噬和分解。然而,膜蛋白的异常导致的红细胞过早清除或者凋亡障碍与多种血液疾病相关,如膜蛋白缺陷、阿尔茨海默症以及高原红细胞增多症。同样在血液保存中,膜蛋白的异常与否往往与血液保存时间的长短有关。探其根源,红细胞膜蛋白的异常以及红细胞程序性死亡与红细胞胞内的PKC激活密切相关。因此,本文通过PMA激活红细胞胞内的PKC,从而探讨激活的PKC与红细胞锚蛋白外翻的关系以及诱导红细胞锚蛋白外翻的机制问题,也进一步探索了激活的PKC诱导红细胞膜骨架结合亲和力的变化与红细胞形变能力的相关关系。希望为深入了解红细胞膜蛋白的结构以及治疗膜蛋白异常的相关血液疾病,同时也对研究人工红细胞的膜骨架蛋白与红细胞变形性能、血液保存过程中血液保存时间的延长等提供细胞和分子层面的探索机理。红细胞锚蛋白为膜内在蛋白,只有当锚蛋白外翻到细胞膜的外侧且锚蛋白RGD序列端也暴露在细胞表面时,巨噬细胞表面的受体分子整合素αvβ3才能与之识别、黏附和吞噬。本研究论文通过PMA激活红细胞胞内的PKC来判断与红细胞程序性死亡紧密相关的胞内PKC的激活能否诱导红细胞锚蛋白的外翻。结果表明,激活的PKC能够诱导红细胞锚蛋白外翻到红细胞膜外侧,然而锚蛋白外翻的红细胞的比例呈PMA浓度依赖关系,而且锚蛋白外翻的红细胞的比例体现出血液捐献者的个体差异性。这意味着尽管PMA诱导PKC的激活能够促使红细胞锚蛋白的外翻,但是锚蛋白外翻的红细胞的比例与胞内游离的PKC对PMA的敏感性以及红细胞胞内PKC活性的异质性有关。为了探讨外翻的锚蛋白与整合素αvβ3的结合能否介导巨噬细胞与红细胞的黏附,本文通过对巨噬细胞黏附红细胞的检测以及封闭整合素αvβ3(封闭膜上的结合位点)和锚蛋白(封闭巨噬细胞表面的结合位点)的结合位点分析。结果表明,锚蛋白的外翻能诱发巨噬细胞的噬红细胞作用,结合位点的封闭能明显降低巨噬细胞对红细胞的黏附数量。红细胞程序性死亡往往起始于细胞内钙离子浓度的升高。提高的胞内钙离子浓度能够激活半胱氨酸肽链内切酶以及钙依赖的酶,从而降解细胞骨架及分解蛋白质,导致细胞囊泡化等,最终细胞调亡。PKC是一种钙离子依赖的酶,激活的PKC能够诱导细胞胞外钙离子的快速流入,促使其胞内钙离子水平的升高。同时激活的PKC也能诱导红细胞膜蛋白的磷酸化,从而导致红细胞膜骨架结合亲和力的减弱。因此,本文运用PKC的抑制剂Calphostin C(封闭PKC的激活位点)和Chelerythrine chloride(竞争性抑制激活的PKC的磷酸化作用位点)来分析钙离子以及锚蛋白的磷酸化与红细胞锚蛋白外翻的关系。结果表明,激活的PKC诱导细胞胞外钙离子的流入以及锚蛋白的磷酸化作用共同促使红细胞锚蛋白的外翻。此外,研究也表明仅仅是胞内钙离子水平的增加或者仅仅锚蛋白的磷酸化作用均不足以诱导红细胞锚蛋白的外翻。为了进一步探讨激活的PKC与红细胞锚蛋白外翻的关系。本文通过不连续密度梯度离心法分离出老红的红细胞层,检测其锚蛋白外翻、胞内钙离子以及锚蛋白磷酸化水平的情况。也检测了PMA诱导不同密度层红细胞的上述指标变化情况。结果表明,在老化层中有一定数目的红细胞呈现其锚蛋白的外翻。同时PMA对不同密度层红细胞的锚蛋白外翻以及胞内钙离子有不同的影响(对不同密度层红细胞锚蛋白的磷酸化水平影响却不大)。这意味着在老化的红细胞中存在着红细胞程序性死亡的信号分子—锚蛋白外翻,同时也进一步确认了诱发红细胞锚蛋白外翻的两个必不可必少的条件(胞内钙离子水平的增加以及红细胞锚蛋白的磷酸化作用)。本论文还检测了PKC诱导的锚蛋白外翻对红细胞变形性能的影响,以及PKC诱导的膜蛋白磷酸化作用导致膜骨架结合亲和力的改变与红细胞形变能力的变化关系。结果显示,锚蛋白的外翻能够引起红细胞变形性能的减弱,锚蛋白的磷酸化作用引起的红细胞膜骨架结合亲和力的改变与红细胞变形指数的变化关系不大,而蛋白4.1的磷酸化作用诱导的红细胞膜骨架结合亲和力的改变在红细胞形变能力的变化关系中有着重要的作用。因此,锚蛋白的外翻以及膜骨架结合亲和力的减少诱导的红细胞形变能力的减弱进一步促进了巨噬细胞对该红细胞的黏附。根据现有的研究成果和已发表的文献,我们推断出激活的PKC一方面诱导了细胞胞外钙离子的流入,然后胞内钙离子水平的提高激活了钙离子依赖的酶,促使了细胞的囊泡化和膜蛋白结合亲和力的减少,另一方面激活的PKC诱导的红细胞锚蛋白的磷酸化,进一步减弱膜骨架蛋白的相互作用,经过这两方面的相互作用,诱导了红细胞锚蛋白的外翻,最终导致巨噬细胞的噬红细胞作用。