海绵共附生放线菌抗肿瘤活性菌株的筛选及菌株A01059活性物质的研究

来源 :华南热带农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ycw
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药物治疗作为肿瘤治疗的主要手段,一直是生物学、医学和药学工作者研究的热点。抗肿瘤新药的开发已突破陆生资源的束缚,拓展到生态和物种远比陆地生境复杂多样的海洋。其中,海洋微生物资源具有种类繁多、活性筛选率高及易于再生的优点,是当前倍受重视的筛选抗肿瘤药物的重要资源宝库,特别引人注目的是,近年来海绵因其丰富的微生物资源成为人们寻找抗肿瘤药物的新资源。本文从海绵放线菌的分离、抗肿瘤活性菌株的筛选、菌株的鉴定、发酵条件的优化、活性物质的分离纯化及结构鉴定等几个方面进行了系统研究,结果如下:先后从海南三亚、琼海及广东湛江采集海绵样品共计20份,采用平板稀释法分离获得335株放线菌。以稻瘟霉-MTT法为筛选模型,获得49株具有抗肿瘤活性的菌株。对其中3株活性强且遗传稳定的放线菌进行了多相分类鉴定,通过对菌株形态特征、培养特征、生理生化特征、16S rDNA序列测定及其系统发育分析,鉴定菌株A01054为洛蒙德链霉菌Streptomyces lomondensis A01054;与菌株A01013 16S rDNA同源性最高的菌株为Streptomyces fradiae(99.4%),在系统发育树上却与所选择菌株的亲缘关系均较远,处于一个独立的分支,有可能属于链霉菌属的一个新种,暂定为链霉菌Streptomyces sp. A01013;菌株A01059 16S rDNA与S. griseocarneus亲缘关系最近,同源性为98.4%,在发育树上处于同一分支,鉴定为Streptomyces griseocarneus A01059,但两者在生理生化等方面存在一些差异。菌株A01013和A01059的16S rDNA在Genbank的登录号分别为DQ304115和DQ319186。研究明确了菌株A01059的最佳发酵工艺和培养基组成。实验考察了碳源、氮源、无机盐、pH值及接种量等对A01059产生抗肿瘤活性物质的影响,并通过正交实验对培养基碳氮源进行了优化。确定菌株A01059液体发酵培养基组成及培养条件为:玉米粉1%,可溶性淀粉1%,黄豆饼粉0.5%,葡萄糖0.5%,海盐1%,pH7.07.5,培养温度28℃,种龄48h,接种量6%,培养时间144h,摇床转速150r/min,250mL三角瓶装液量100mL。在此优化条件下,菌株A01059发酵液对人肝癌细胞SMMC-7721、小鼠肉瘤细胞S180的抑制率分别为95%和94%。同时进行了10L罐发酵放大实验。菌株A01059发酵液中抗肿瘤活性成分为脂溶性,经乙酸乙酯萃取获得活性物质粗提物,通过半制备型液相层析分离获得2种活性化合物,HPLC分析检测其纯度分别达到97.32%和97.85%。运用核磁共振(1H-NMR、13C-NMR、H-H NMR、HMBC、HSQC)、质谱(ESIMS)、紫外光谱(UV)等现代波谱技术,初步鉴定了2种活性化合物的结构。经检索,它们属于新结构类型化合物。
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