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研究背景和目的USP7作为一个去泛素酶在肿瘤的发生发展进程中发挥着一定的作用;Ki-67作为一个细胞增殖的标记分子,同时也参与促进肿瘤的发展与转移。我们在非小细胞肺癌中发现USP7能够调控Ki-67促进癌症的发展。研究方法1.应用免疫组织化学方法检测正常肺组织和NSCLC组织中USP7表达;应用Western blot、Real-time PCR方法检测人正常肺上皮细胞Beas2B和NSCLC细胞中USP7蛋白和m RNA;通过在NSCLC细胞中用USP7活性抑制剂P22077及转染USP7 si RNA质粒干预后,运用CCK8和AO-EB双荧光染色法检测细胞的增殖和存活状态。2.在NSCLC细胞中用P22077及转染USP7 si RNA质粒干预后,通过Western blot检测MCM2、PCNA蛋白表达,通过细胞免疫荧光(CIF)检测Ki-67蛋白表达;运用CIF检测人正常肺上皮细胞Beas2B和NSCLC细胞中Ki-67蛋白表达;运用免疫组织化学方法检测正常肺组织和NSCLC组织中Ki-67表达;通过裸鼠皮下移植瘤实验检测转染USP7 si RNA质粒的A549细胞增殖成瘤体积。3.通过Real-time PCR检测人正常肺上皮细胞Beas2B和NSCLC细胞中Ki-67m RNA表达和在NSCLC细胞中用P22077及转染USP7 si RNA质粒干预后,Ki-67m RNA的表达情况;应用CIF,在NSCLC细胞中检测USP7与Ki-67的定位情况;应用MG132及转染USP7 C223A突变质粒后,进一步研究USP7对Ki-67的调控机制;通过CCK8实验,检测转染USP7 si RNA质粒后细胞对药物敏感性影响。研究结果1.在NSCLC组织中USP7在核内高表达,并且分化程度越低的组织表达越高;与Beas2B细胞相比NSCLC细胞中USP7的蛋白和m RNA均高表达;应用P22077及转染USP7 si RNA质粒检测NSCLC细胞的增殖效率降低,细胞保持存活状态。2.在NSCLC细胞中应用P22077和转染USP7 si RNA质粒后MCM2、PCNA的蛋白表达不变,Ki-67蛋白表达减少;与Beas2B细胞相比NSCLC细胞中Ki-67的蛋白高表达;在NSCLC组织中Ki-67也在核内高表达,并且分化程度越低的组织表达越高;在A549细胞中转染USP7 si RNA质粒后,细胞裸鼠皮下移植瘤与对照组和NC组比瘤体体积减少显著。3.在Beas2B和NSCLC细胞Ki-67的m RNA基本一致,在NSCLC细胞中应用P22077、转染USP7 si RNA质粒后,Ki-67 m RNA保持不变;在NSCLC细胞中USP7和Ki-67有共定位现象;MG132拮抗P22077所诱导对Ki-67蛋白表达下调作用,应用MG132后在转染USP7 si RNA细胞中Ki-67蛋白表达恢复;过表达USP7 C223A后,Ki-67蛋白表达减少;转染USP7 si RNA质粒的细胞对药物敏感性无变化,甚至还有所提高。研究结论1.USP7在NSCLC组织和细胞中过表达,并且抑制USP7活性或者下调USP7后均可以减慢细胞增殖,但细胞仍存活。2.USP7可以调控Ki-67的蛋白表达,并且Ki-67在NSCLC组织和细胞中过表达,下调USP7后,裸鼠皮下移植瘤与对照组和NC组比瘤体体积减少显著,同时Ki-67表达也下调。3.在NSCLC细胞中,USP7通过去泛素作用调节Ki-67的蛋白稳定性。