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目的:本试验采用体外细胞培养的方法,探讨辛伐他汀对体外培养人牙髓细胞(human dental pulp cells, HDPCs)的细胞增殖、矿化、细胞周期及碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。方法:选择年龄为18-28岁新鲜拔除的健康、完整、无龋、无隐裂的恒牙或第三磨牙(河北医科大学第二医院口腔外科提供)。采用组织块酶解法培养细胞。待细胞长出后在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。细胞传代成功后,取第4代对数生长期人牙髓细胞进行细胞爬片,用SABC法进行波形丝蛋白和角蛋白免疫组织化学染色,鉴定细胞来源。MTT比色法检测辛伐他汀对人牙髓细胞增殖能力的影响:1)选用第4代生长良好的牙髓细胞,制备1×104个/ml的细胞悬液,接种于96孔板,每孔100μl。2)细胞长满孔底后,弃去孔中的培养液,用PBS浸洗细胞。3)实验分为对照组、空白对照组和实验组,每组设5个孔。对照组:在有细胞的孔内加入150μl完全培养液(含2%胎牛血清的高糖DMEM培养液)。空白对照组:在无细胞的孔内加入150μl的完全培养液。实验组:在有细胞的孔内分别加入150μl用完全培养液配制的终末浓度分别为10-9 mol/L,10-8 mol/L,10-7 mol/L和10-6mol/L的辛伐他汀溶液。4)分别培养至第1d、5d时,弃孔中培养液,以PBS冲洗,在所需检测的培养孔内每孔加入四甲基偶氮唑盐(MTT)溶液(5mg/mL)20μL,37℃下继续孵育4h,终止培养,吸弃孔内上清液,在每孔分别加入100μL二甲基亚砜(DMSO),室温下轻微振荡5min。以空白对照孔调零,选择492nm波长,在酶标仪上检测各孔吸光度值(A)。检测辛伐他汀对人牙髓细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的影响:1)选用第4代生长良好的牙髓细胞,制备1×104个/mL的细胞悬液,接种于96孔板,每孔100μl。2)等细胞长满孔底后,弃去孔中的培养液,用PBS浸洗细胞。3)实验分为对照组、空白对照组和实验组,每组设5个孔。对照组:在有细胞的孔内加入150μl完全培养液(含2%胎牛血清的高糖DMEM培养液)。空白对照组:在无细胞的孔内加入150μl的完全培养液。实验组:在有细胞的孔内分别加入150μl用完全培养液配制的终末浓度分别为10-9 mol/L,10-8 mol/L,10-7 mol/L和10-6mol/L的辛伐他汀溶液。4)分别继续培养至第1d、5d时,弃孔中培养液,用PBS冲洗,每孔加入50μL(1g/L)的Triton X-100,4℃过夜,在镜下观察细胞完全裂解后,每孔分别加入ALP底物混合液100μL,培养箱内37℃孵育30min,以0.5mol/L氢氧化钠液终止反应,在室温中振荡5min,在酶标仪上测定410nm下每孔的吸光度A值。细胞周期的测定:1)选用第4代生长良好的牙髓细胞,制备5×104个/ml的细胞悬液,接种于25mL培养瓶中。细胞贴壁后换用含15%FBS的DMEM继续培养24h。2)实验分实验组和对照组,每组3瓶。实验组加四甲基偶氮唑盐实验中促进细胞增殖率最佳的10-7mol/L辛伐他汀培养液。对照组加等量含15%FBS(标准型胎牛血清)的DMEM。3)培养2d后弃液,用胰蛋白酶消化,分别收集到各自的离心管内,加入70%冰乙醇固定,4℃冰箱保存。4)细胞周期检测时,吸取100μL的细胞悬液,加入含有浓度为1%RNA酶、5%Triton-100和5mg/L PI的DNA荧光染料400μL,在室温下孵育30min后,用流式细胞仪测定细胞周期。茜素红染色法检测辛伐他汀对人牙髓细胞矿化结节形成的影响,选用第4代生长良好的牙髓细胞,制备2×104个/ml的细胞悬液,接种于六孔板内,分为未诱导组和10-7mmol/L浓度的辛伐他汀处理后的矿化诱导组,每组设3个复孔。培养20d后,进行茜素红染色检测矿化结节形成的情况。结果:1牙髓细胞的免疫组化染色结果显示为波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性。证实牙髓细胞的组织来源为中胚层间充质细胞,并且无上皮细胞混杂,符合实验要求。2与对照组相比,辛伐他汀可促进人牙髓细胞的细胞周期进程、碱性磷酸酶活性及矿化能力(P<0.05),其中以10-7mol/L的辛伐他汀作用最明显。与对照组相比,低浓度的辛伐他汀(10-9 mol/L,10-8 mol/L,10-7 mol/L)促进牙髓细胞的增殖(P<0.05),但是高浓度(10-6mol/L)的辛伐他汀表现出抑制细胞增殖的效应,与对照组相比有显著性差异(p<0.05)。结论:本研究显示辛伐他汀在低浓度下促进人牙髓细胞的增殖,在高浓度下抑制人牙髓细胞的增殖;辛伐他汀可以提高人牙髓细胞碱性磷酸酶的活性和矿化能力;辛伐他汀能促进牙髓细胞的DNA合成及有丝分裂。