研究背景:心房颤动(Atrial fibrillation,AF)是最常见的有临床意义的心律失常。流行病学研究显示我国18岁以上成人患病率达0.77%,且由于人口老龄化进程加速等原因,房颤发病率逐年增加,欧洲研究显示40岁以上人群一生发生房颤风险达25%。由于对心功能的不良影响及潜在栓塞并发症等因素。房颤患者死亡率较非房颤患者增加1.5-2倍。目前虽然它的治疗有多种方法可供选择,但不管是抗心律失常药物治疗还是以射频消融为主的介入治疗,其疗效及安全性均不能令人满意。因此,明确房颤发生和维持机制对寻找房颤的有效干预措施临床意义尤为重要。大量研究均证实以心房电重构和结构重构为主的心房重构对房颤的发生和维持发挥着重要作用。研究证实房颤时心房肌组织存在氧化应激状态。氧化应激参与了房颤心房电重构和结构重构的进程。但对于氧化应激在房颤进程中的作用大小、具体信号通路及调控机制目前尚不完全清楚。沉默因子 2-相关酶类(Silent information regulator 2-related enzymes,sirtuins)是近年来发现的一类重要的组蛋白去乙酰化酶,在长寿和DNA修复等方面发挥重要作用。哺乳动物Sirtuins同源蛋白家族SIRT由7个SIRT类似物组成,分别被命名为沉默信息调节因子2相关酶1-7(SIRT1-SIRT7)。Sirtuin3(SIRT3)是该家族最为活跃的成员之一,SIRT3是一种重要的线粒体NAD+依赖的去乙酰化酶,主要存在于线粒体中,目前已有研究证实SIRT3在某些病理状态下对组织活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生和清除均能产生重要影响。Klishadil等研究发现缺血再灌注损伤兔模型心室肌存在氧化应激损伤及SIRT3表达减低,氯沙坦能通过提高SIRT3蛋白表达水平发挥抗氧化应激、抗心肌缺血再灌注损伤作用。Sultana等研究发现大蒜素能通过上调SIRT3蛋白水平表达来发挥预防糖尿病大鼠心肌氧化应激损伤和线粒体功能障碍作用。我们推测SIRT3有可能参与房颤时氧化应激损伤进程。他汀类药物作为目前临床应用最广泛的调脂药物,大量研究证实其在降低低密度脂蛋白胆固醇作用之外,还具有抗炎、稳定斑块、抗氧化应激等调脂外作用。Shida等研究显示大剂量氟伐他汀能通过抗氧化应激机制改善糖尿病大鼠微循环,从而减轻其心室收缩功能损害。Ishibashi等研究显示瑞舒伐他汀钙能对抗因衰老导致的SIRT1低表达,减轻细胞内氧化应激。Antoniades等研究显示CABG患者术前短时间应用阿托伐他汀能抑制心房肌氧化应激损伤。我们推测他汀类药物有可能通过SIRT3途径调控房颤时氧化应激损伤过程。研究目的:1.选择两种刺激持续时间分别进行快速心房起搏,确定能够建立兔心房颤动动物模型的有效方法;2.通过检测房颤动物模型心房肌氧化应激水平及SIRT3、FOX03a等因子水平变化,探讨SIRT3在房颤氧化应激损伤中的可能作用;3.应用阿托伐他汀对实验动物进行干预,了解阿托伐他汀能否影响SIRT3途径从而干预心房颤动,同时观察其对心房肌氧化应激损伤的影响。研究方法:1.快速起搏兔房颤动物模型建立:1%戊巴比妥钠2ml/Kg经耳缘静脉缓慢静脉注射,其后以1ml/kg/h微量注射泵持续泵入进行麻醉。经颈部正中切口,分离并切开气管,插管连接动物呼吸机辅助通气,设置潮气量l0ml/kg,呼吸频率50次/分。分离右侧颈静脉,用眼科剪切开并经J型导丝置入5F动脉鞘管,注入1000IU肝素,结扎固定鞘管,经鞘管缓慢送入5F10极固定弯电极并调整方向,送入过程中同步记录1、2极腔内电图,当显示局部电图A波呈正负双向且振幅较大时提示电极头端位于右房理想位置,连接电极尾线至生物机能实验系统刺激仪,设置1、2极作为刺激电极,3、4极作为记录电极。回形针头端磨尖刺入兔四肢皮下并连接体表心电导联记录体表心电图。结合体表及腔内心电图验证起搏是否有效,验证起搏有效后固定10极电极,以600次/分频率,2ms脉宽、2倍阈值刺激强度持续起搏右心房。2.实验动物分组:健康新西兰大耳雄性白兔40只,根据随即单位组设计分组法利用随机数字表随机均匀分为4组,每组10只。具体分组如下:假手术组(Sham组):经颈静脉置入电极导管至右心房,留置导管但不进行刺激,12小时后处死动物;短时间起搏组(Short-time pacing,SP组):置入电极导管后以600次/分频率持续刺激右心房6小时;长时间起搏组(Long-time pacing,LP组):以600次/分频率持续刺激右心房12小时;长时间起搏+阿托伐他汀干预组(Long-time pacing+atorvastatin intervention,AI 组):手术前一周开始应用阿托伐他汀2.5mg/kg/日进行干预至手术当日,其后植入电极导管以600次/分频率持续刺激右心房12小时。3.指标测定:实验结束后留取左心房组织,光镜及透射电镜观察心房组织结构变化,Masson染色观察心房组织胶原纤维沉积情况并通过Image-ProPlus6.0软件计算心房肌胶原容积分数;比色法测定左心房组织丙二醛(malon dialdehyde,MDA)、ROS含量以及锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide superoxide dismutase,MnSOD)活性;蛋白印迹法检测左心房组织 SIRT3,转录因子 FOX03a(Forkheadbox03,FOX03a)、MnSOD 蛋白表达水平;实时荧光定量反转录聚合酶链反应检测左心房组织中SIRT3、FOX03a、MnSOD mRNA表达水平。研究结果:1.实验过程顺利,所有动物均顺利经颈静脉置入10极电极至右心房,心电图证实600次/分起搏能持续夺获心房,实验过程中死亡4只,其中Sham组、AI组各一只,LP组两只,共36只兔完成实验。2.心房组织结构变化:H-E染色结果:同Sham组相比,LP组和AI组均可见心房肌细胞大小不均、排列紊乱,组织结构破坏、间质水肿、细胞间隙纤维组织填充,其中LP组变化较AI组更为明显。SP组可见轻微心房组织结构损害,细胞大小不一致,排列紊乱、间质轻度水肿,无明显间质纤维化。Masson染色结果:同Sham组相比,LP组和AI组心房肌组织胶原阳性染色明显增多,不仅位于血管周围,而且心肌细胞间质胶原沉积明显增多,其中AI组心肌胶原容积分数明显小于LP组,SP组间质胶原沉积较少,胶原容积分数同Sham组相比无统计学差异。电镜结果:同Sham组相比,其余三组均存在不同程度的组织超微结构损伤,包括肌纤维排列紊乱、肌节结构不完整、线粒体肌纤维核膜缝隙连接损伤、线粒体增多、大小不一,严重者局部可见少量核残体。其中SP组损伤较轻,LP组损伤程度最为严重。AI组损伤严重程度轻于LP组。3.LP组MDA、ROS含量明显高于Sham组和SP组,MnSOD活性低于Sham组和SP组(P<0.05),AI组MDA、ROS含量明显低于LP组,MnSOD活性高于LP组(P<0.05),SP组MDA、ROS含量及MnSOD活性同Sham组相比均无统计学差异(P>0.05)。4.LP 组 MnSOD、SIRT3 蛋白表达水平低于 Sham 组(P<0.05);AI 组 SIRT3及核内FOX03a蛋白表达水平高于LP组(P<0.05),MnSOD蛋白表达水平同LP组相比无统计学差异(P>0.05);SP组SIRT3、MnSOD、FOX03a蛋白水平同Sham组相比均无统计学差异(P>0.05);实验兔SIRT3蛋白表达水平同心房组织ROS含量呈负相关关系(P<0.01)。5.LP组SIRT3 mRNA和MnSODmRNA表达水平明显低于Sham组和SP组(P<0.05),SP组和Sham组之间SIRT3 mRNA和MnSODmRNA表达水平均无统计学差异(P>0.05),AI 组 SIRT3 mRNA 和 MnSOD mRNA 表达水平明显高于 LP 组(P<0.05)。四组之间FOXO3amRNA表达水平均无统计学差异(P>0.05)。研究结论:1..12小时持续快速心房起搏可导致兔心房组织产生氧化应激损伤及结构重构,是制作房颤动物模型的有效方法;2.快速起搏兔房颤动物模型心房组织SIRT3表达水平下降,其表达水平变化同心房氧化应激损伤有相关性;3.阿托伐他汀钙能上调SIRT蛋白及mRNA表达,有效减轻快速起搏兔心房组织氧化应激损伤及心房结构重构。研究背景:心房颤动(Atrial fibrillation,AF)是最常见的有临床意义的心律失常。流行病学研究显示我国18岁以上成人患病率达0.77%,且由于人口老龄化进程加速等原因,房颤发病率逐年增加,欧洲研究显示40岁以上人群一生发生房颤风险达25%。由于对心功能的不良影响及潜在栓塞并发症等因素。房颤患者死亡率较非房颤患者增加1.5-2倍。目前虽然它的治疗有多种方法可供选择,但不管是抗心律失常药物治疗还是以射频消融为主的介入治疗,其疗效及安全性均不能令人满意。因此,明确房颤发生和维持机制对寻找房颤的有效干预措施有着重要的临床意义。大量研究均证实心房重构,包括电重构和结构重构,对房颤的发生和维持发挥重要作用。研究证实房颤时心房肌组织存在氧化应激状态。氧化应激参与了房颤心房电重构和结构重构的进程。但对于氧化应激在房颤进程中的作用大小、具体信号通路及调控机制目前尚不完全清楚。沉默因子 2-相关酶类(Silent information regulator 2-related enzymes,sirtuins)是近年来发现的一类重要的组蛋白去乙酰化酶,在长寿和DNA修复等方面发挥重要作用。哺乳动物Sirtuins同源蛋白家族SIRT有7个SIRT类似物,分别是沉默信息调节因子2相关酶1-7(SIRT1-SIRT7)。Sirtuin3(SIRT3)是该家族最为活跃的成员之一,是一种重要的线粒体NAD+依赖的去乙酰化酶,主要存在于线粒体中,目前已有研究证实SIRT3在某些病理状态下对组织活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生和清除均能产生重要影响。Klishadil等研究发现缺血再灌注损伤兔心室肌存在氧化应激损伤及SIRT3表达减低,氯沙坦能通过提高SIRT3蛋白表达水平发挥抗氧化应激、抗心肌缺血再灌注损伤作用。Sultana等研究发现大蒜素能通过上调SIRT3蛋白水平表达来发挥预防糖尿病大鼠心肌氧化应激损伤和线粒体功能障碍作用。我们推测SIRT3有可能参与房颤时氧化应激损伤进程。研究目的:1.明确风湿性心脏瓣膜病合并房颤患者心房组织沉默调节因子2-3(SIRT3)变化情况,探讨其与心房组织氧化应激的可能关系。2.测量外周血及右心耳MDA含量,探讨外周血MDA能否作为评价心房氧化应激程度的可靠指标。研究方法:根据是否合并持续性房颤将因风湿性心脏病二尖瓣狭窄住院接受外科瓣膜置换手术的患者分为2组:持续性房颤组(AF组,n=28)和窦性心律组(SR组,n=12)。术前收集一般临床资料、经胸心脏超声测量左房前后径、左室射血分数。在体外循环手术开始前收集外周血标本,硫代巴比妥酸法检测外周血丙二醛(MDA)的含量。术中收集右心耳组织标本,H-E染色观察心房组织结构,Masson染色后采用胶原半定量方法测量胶原容积分数评价心房纤维化程度;比色法测定左心房组织丙二醛(MDA)、总活性氧(ROS)的含量;Western blot检测右心耳组织中SIRT3、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)蛋白的表达;实时荧光定量反转录聚合酶链反应检测右心耳组织中SIRT3、FOX03a、MnSOD mRNA表达水平。研究结果:1.AF组患者左房内径及右心耳组织胶原容积分数明显高于SR组(P<0.01)。2.AF患者血MDA含量高于SR组(P<0.01)。3.AF组患者心房组织MDA、ROS含量高于SR组(P<0.01)。4.所有患者心房组织MDA含量同外周血MDA含量呈中度相关关系(r=0.65,R2=0.42:P<0.01)。5.AF组患者SIRT3蛋白、MnSOD蛋白表达水平表达低于SR组,(P<0.05)。6.同SR组相比,AF组患者MnSOD mRNA和SIRT3mmRNA表达水平降低(P<0.05),FOX03amRNA表达水平无统计学差异(P>0.05)。7.AF组患者SIRT3蛋白表达水平同ROS含量和左房内径呈负相关,同MnSOD蛋白表达水平呈正相关(P<0.01)。研究结论1.风湿性心脏瓣膜病房颤患者心房组织存在氧化应激损伤。2.风湿性心脏瓣膜病房颤患者心房肌SIRT3水平下降。3.风湿性心脏瓣膜病房颤患者心房肌SIRT3表达水平同氧化应激损伤程度有相关关系。