目的：　　 小于胎龄儿(Small for gestational age,SGA)是指出生体重或/和身长在同胎龄平均出生体重或/和身长的第10百分位以下,或低于2个标准差的新生儿。近年来大量流行病学调查证实SGA与成年期代谢综合征有关,目前为大多数学者所接受的可能发生机制是“节俭表型”假说,Cianfarani根据SGA生后早期快速生长追赶现象提出“生长追赶”假说。但迄今为止,SGA个体发生胰岛素抵抗的生物学机制及其与生长追赶的关系并不清楚。生长激素和胰岛素对生长中的SGA个体的生长和代谢具双重调控作用,它们两者共享受体后信号通路,并能经此实现两激素的交联对话(cross-talk)以及在生物效应上发生彼此影响。已有研究显示两者可能在STAT5、SOCS(Suppressor of cytokine signaling)蛋白和胰岛素信号通路IRS-1/2、PI3K、Akt、ERK1/2水平存在受体后交联对话,这也可能是联系生长与胰岛素抵抗的分子基础。本课题拟以临床和实验配套研究SGA个体生长追赶和胰岛素抵抗的关系。首先临床研究SGA儿童的线性生长和体重追赶生长与胰岛素抵抗的关系,并进一步建立有生长追赶SGA大鼠模型,从组织层面和受体后分子层面探讨SGA胰岛素抵抗的可能机制及其与追赶生长的关系。　　 方法：　　 一、临床研究方法　　 病例取自中山大学附属第一医院儿科内分泌专科门诊。67例SGA和42例适于胎龄儿(Appropriate for gestational age,AGA)均为足月产、青春发育前期,不伴肥胖。SGA标准是胎龄别出生体重或/和身长≤-2SDS。有生长追赶SGA(CuG-SGA)标准是就诊时HtSDSTC>-2SDS(TC:遗传靶身高)(n=30；16 F,14 M)；无生长追赶SGA(NCUG-SGA)是就诊时Ht SDSTc≤-2SDS,且△HtSDS<0(n=37；15F,22M)。　　 所有研究对象采集清晨空腹血,测定血糖、胰岛素、IGF-1浓度,计算胰岛素抵抗指数和胰岛β细胞功能指数。　　 二、实验研究方法　　 1、动物模型的制备:健康Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重230-280克(雌性)/280-320克(雄性),按雌雄2:1比例合笼。孕鼠随机分成两组,对照组予标准饲料喂养每日进食饲料量为18-20克,限食实验组自妊娠第1天起每日进食饲料量为8-9克。所有孕鼠自然分娩。新生鼠出生体重和/或出生身长在正常对照组平均出生体重和/或出生身长的-2SDS以下者为SGA新生鼠模型。SGA新生鼠随机分为两组,①对照组:标准饲料喂养。②高蛋白饮食干预组:高蛋白鼠饲料喂养(饲料含粗蛋白28.6g/100g,热卡构成比31％)。各组予上述鼠饲料喂养母鼠,子鼠母乳喂养,满3周龄断乳后继续予相应鼠饲料喂养至实验结束。以满4周龄时身长及体重位于正常对照组平均身长及体重-2SDS以下者为NCUG-SGA鼠,位于-2SDS以上者为CUG-SGA鼠。　　 2、实验对象与标本采集　　 1)满4周龄幼鼠实验分组和标本采集:　　 满4周龄时每组选取16只幼鼠随机分为2个处理组。①基础对照组:处死前不予任何特殊处理。②胰岛素激发组:处死前半小时予腹腔注射胰岛素3.0 IU/100g。　　 另选取标准饲料喂养CUG-SGA和AGA幼鼠各18只随机分为3个处理组。①对照组:处死前不予任何特殊处理；②胰岛素激发组:处死前半小时予腹腔注射胰岛素3.0 IU/100g；③GH受体阻滞+胰岛素激发组:处死前50小时、2小时分别予Somavert0.001mg/g腹腔内注射,处死前半小时予胰岛素激发。　　 各组满4周龄时留取48/24小时尿、禁食后采用摘眼球法取血,分离血清,测定血糖浓度,余血样-70℃保存,备测胰岛素、IGF-1浓度。处死后电子天平称取双肾周脂肪重量；取肝脏、肾周脂肪和腓肠肌组织标本-70℃保存备测。　　 2)满6周龄、8周龄大鼠实验分组和标本采集:随机选取标准饲料喂养NCUG-SGA、CUG-SGA和AGA鼠各16只；同时随机选取高蛋白饲料喂养CUG-SGA鼠各16只,分别在满6周龄(每组各8只)、8周龄时(每组各8只)留取双肾周脂肪标本,处死前不予任何处理。　　 3、各指标检测方法:采用过氧化物酶法测定血糖浓度；采用免疫放射分析法测定尿24小时GH排泄率和血浆胰岛素浓度、采用ELISA法测定IGF-1浓度,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)与β细胞功能指数(HOMA％)；免疫组化法测定胫骨生长板IGF-1、IGF-1R表达并行半定量分析:荧光定量RT-PCR法测定肝脏组织IGF-1 mRNA表达。肾周脂肪组织HE染色测量脂肪细胞直径,计算脂肪细胞数相对值；应用WesternBlot分析SOCS3蛋白以及信号分子STAT5、IRS-1、Akt和ERK的表达及其磷酸化情况,并以Tubulin蛋白为内参照。　　 结果：　　 一、临床研究结果　　 1、CUG-SGA组HOMA-IR和INS均较NCUG-SGA(PHOMA-IR=0.002,PINS=0.002)和AGA组(PHOMA-IR=0.036,PINS=0.022)显著为高,而NCUG-SGA组与AGA组相比无显著性差异(P>0.05)。CUG-SGA组IGF-1水平较NCU-SGA组显著为高(P=0.001),但与AGA组无显著性差异(P=0.095)。　　 2、SGA组HOMA-IR与年龄、△Ht SDS和BMI正相关。≤6岁SGA组INS与△Ht SDS和IGF-1呈显著正相关；>6岁SGA组INS与△Wt SDS和△Ht SDS呈正相关,与IGF-1不相关。　　 二、实验研究结果　　 (一)SGA鼠体格生长情况:限食造模孕鼠SGA出生率89.96％。满4周龄时有生长追赶SGA鼠43.90％。CUG-SGA鼠出生身长显著大于NCUG-SGA组(P=0.028),并与4W时身长、体重呈正相关(r=0.513,0.679)。CUG-SGA幼鼠在生后1W内呈现明显的身长和体重生长追赶,4W时胫骨、股骨长度与AGA组无显著性差异。　　 (二)SGA鼠促生长素轴改变　　 1.尿GH和血IGF-1水平:尿GH水平CUG-SGA显著高于NCUG-SGA和AGA两组(P=0.012,0.004)；血IGF-1水平CUG-SGA显著高于NCUG-SGA组(P=0.006),与AGA组无统计学差异。　　 2.胫骨生长板形态学的改变:SGA鼠生长板增殖区每柱细胞数较少,各期软骨细胞排列不规则。NCUG-SGA组生长板总厚度、各区厚度均较CUG-SGA和AGA组显著降低;CUG-SGA组生长板厚度与AGA无差异,但肥大区厚度较NCUG-SGA和AGA组显著增高(P=0.000,0.022)。　　 3.胫骨生长板软骨细胞IGF-1、IGF-1R表达:CUG-SGA组IGF-1表达较NCUG-SGA显著增多(P=0.005),与AGA组比较无差异:三组问IGF-1R表达无统计学差异(P=0.341)。　　 4.肝脏IGF-1 mRNA表达:CUG-SGA组IGF-1 mRNA表达较NCUG-SGA显著增高(P=0.006),与AGA相比无统计学差异。　　 (三)SGA鼠代谢轴及胰岛素受体后信号变化　　 1.血INS水平和HOMA-IR、HOMA％:CUG-SGA组血INS水平和HOMA-IR较NCUG-SGA和AGA显著增高(P均<0.01);CUG-SGA和NCUG-SGA组HOMA％均较AGA显著增高,但CUG-SGA和NCUG-SGA两组间并无显著性差异。　　 2.肾周脂肪量:4W时CUG-SGA组肾周脂肪量与AGA组相近；8W时CUG-SGA和NCUG-SGA组均明显超过AGA(P=0.002,0.008)。　　 3.肾周脂肪细胞形态学:4W时CUG-SGA和NCUG-SGA组肾周脂肪细胞直径显著小于AGA组,两组脂肪细胞数显著高于AGA组；8W时NCUG-SGA脂肪细胞直径与AGA组接近,CUG-SGA则明显超过AGA组。　　 4.肌肉组织IRS-1、Akt、ERK活性:　　 4.1.磷酸化IRS-1表达CUG-SGA基础状态下已有IRS-1磷酸化,INS激发后磷酸化IRS-1的表达无显著增加,其INS激发/基础比值显著低于AGA组(1.117±0.064vs22.560±1.772)；NCUG-SGA基础状态下亦有低水平磷酸化IRS-1,INS激发后磷酸化IRS-1的表达较基础值增加2倍以上,但其INS激发/基础比值显著低于AGA组(4.161±0.239vs22.560±1.772)。　　 4.2.磷酸化Akt的表达在CUG-SGA、NCUG-SGA组磷酸化Akt的表达在基础状态和INS激发后均较AGA组显著减低,而CUG-SGA组磷酸化Akt的表达更较NCUG-SGA减低50％。　　 4.3.磷酸化ERK表达CUG-SGA基础状态下已有显著的磷酸化ERK表达,NCUG-SGA基础状态下磷酸化ERK表达较CUG-SGA组为低,INS激发后两组磷酸化ERK表达均显著下降。相关分析显示在基础状态以及胰岛素激发状态,SGA鼠p-Akt表达与p-ERK表达呈显著负相关性(r=0.737,P=0.026；r=0.658,P=0.019)。　　 (四)GHR阻断前后SOCS3蛋白以及生长轴、胰岛素受体后信号分子的变化　　 1.不同处理组CUG-SGA血IGF-1水平:CUG-SGA予以GH受体阻滞后INS激发其IGF-1水平与前两组相比无明显下降(P=0.367)。　　 2.不同处理组CUG-SGA肌肉组织IGF-1 mRNA表达:三组间IGF-1 mRNA表达无统计学差异(P=0.103)。　　 3.CUG-SGA、NCUG-SGA和AGA幼鼠肌肉组织SOCS3的表达:AGA鼠生理状态下SOCS3表达水平极低。CUG-SGA SOCS3表达明显高于NCUG-SGA和AGA组,INS激发前后SOCS3表达无明显差异。　　 4.CUG-SGA、NCUG-SGA和AGA幼鼠肌肉组织STAT5的活性:CUG-SGA磷酸化STAT5在基础状态较NCUG-SGA和AGA组明显增高,INS激发后磷酸化STATS水平有所下降,仍不低于NCUG-SGA和AGA组。　　 5.GHR阻断后信号分子的变化:CUG-SGA组SOCS3的高水平表达于GH受体阻断后显著减少；磷酸化STAT5水平在GH受体阻断后INS激发状态与基础值并无明显差异；磷酸化IRS-1和磷酸化Akt水平在GH受体阻断后INS激发状态较阻断前明显增高,与AGA相比有统计学差异。　　 (五)高蛋白饮食干预结果　　 1.体格生长情况:4W时SGA子鼠生长追赶率36.67％。高蛋白饮食CUG-SGA组体重显著低于标准饮食组(P=0.028),与AGA组无显著差异。　　 2.肾周脂肪量、脂肪细胞形态学变化:8W时高蛋白饮食CUG-SGA肾周脂肪量、脂肪细胞大小均较标准饮食组显著减少(P<0.05),但肾周脂肪量仍显著高于AGA组(P=0.001)。　　 3.血胰岛素抵抗指标的变化:高蛋白饮食CUG-SGA组INS和HOMA-IR较标准饮食组显著降低(P＜0.01),但仍高于AGA组。　　 4.肌肉组织SOCS3表达的变化:高蛋白饮食CUG-SGA组SOCS3的表达在基础状态和INS激发后与标准饮食组无显著差异。　　 5.肌肉组织胰岛素受体后信号分子IRS-1、Akt活性的变化:高蛋白饮食CUG-SGA基础状态和INS激发后磷酸化IRS-1与标准饮食组无明显差异；而磷酸化Akt在基础状态即有高水平表达,INS激发后明显降低,与标准饮食组相比有统计学差异。　　 结论：　　 1、经对SGA个体临床和大鼠模型的配套研究,发现SGA的IR分别与体重追赶和线性生长追赶相关的规律,体脂追赶对IR发生的贡献更为重要。　　 2、生长追赶和IR是并存而互为影响的事件。胰岛素受体后2条主要信号通路的转导异常是生长追赶和IR有密切相关的受体后机制:PI3K-Akt信号通路的损害在生长追赶SGA为重,但它经受体后信号交联使MAPK-ERK通路慢性激活而产生促生长效应。　　 3、SGA个体宫内代谢重整所致GH和胰岛素通路异常共同参与了其幼年的生长追赶和IR。GH受体后的信号异常损害了胰岛素通路IRS-1-Akt间信号的转导；但慢性高GH和高胰岛素状态共同激活了两者共享的STAT5和MAPK-ERK通路产生促生长效应。　　 4、有生长追赶SGA个体的高GH状态诱导SOCS-3显著上调,它可能是胰岛素受体后通路信号转导异常的分子机制之一。　　 5、生后高蛋白饮食模式在一定程度上能改善有生长追赶SGA鼠的IR,可能是经减缓体脂追赶而实现；但宫内已发生的胰岛素受体后信号通路损害难以经此干预逆转。