【摘 要】
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非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）作为高致病性传病毒,可导致家猪发热出血,表现形式为高感染率与高死亡率,致死率最高可达100%。2018年在中国暴发以来,给家猪养殖业带来了毁灭性的打击。CD2v蛋白位于非洲猪瘟病毒的外囊膜,具有良好的抗原性,能使宿主对病毒产生部分保护,并介导病毒与细胞的黏附,因此CD2v蛋白是诊断试剂开发和疫苗候选抗原开发的重要靶标。1.
【基金项目】
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国家自然科学基金专项项目（编号:31941001）； 2022年度河南省重大科技专项,非洲猪瘟等重大动物疫病的疫苗研发及综合防控关键技术研究（编号:221100110600）；
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非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）作为高致病性传病毒,可导致家猪发热出血,表现形式为高感染率与高死亡率,致死率最高可达100%。2018年在中国暴发以来,给家猪养殖业带来了毁灭性的打击。CD2v蛋白位于非洲猪瘟病毒的外囊膜,具有良好的抗原性,能使宿主对病毒产生部分保护,并介导病毒与细胞的黏附,因此CD2v蛋白是诊断试剂开发和疫苗候选抗原开发的重要靶标。1.非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的真核表达与纯化首先将构建好的p CGS3-CD2v质粒电转到CHO细胞,通过亚克隆方法筛选到稳定表达CD2v蛋白的CHO细胞系。通过收集细胞系表达上清,经SDS-PAGE,Dot-Blot和Western-Blot来检测蛋白的高效表达。使用阴离子交换层析技术纯化获得了高纯度的CD2v蛋白,通过SDS-PAGE、Western-Blot鉴定,获得了高纯度（90%）、高浓度（1.27 mg/m L）的CD2v蛋白。2.非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体的制备与筛选通过CD2v蛋白免疫BALB/c小鼠,杂交瘤细胞融合,有限稀释,ELISA、IFA、Western-Blot和IPMA等步骤筛选到4株阳性单克隆细胞,分别为:2H10、4C1、7A9和11E2。通过ELISA检测,抗体效价在2株在1:512000以上,1株在1:1024000,1株为2048000。将高效价的11E2单克隆抗体耦联至填料,制备以单克隆抗体为基础特异性结合CD2v蛋白的亲和层析柱,具有较好的偶联效率,为纯化CD2v蛋白建立快速便捷的纯化方法。3.非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体与抗原表位的鉴定将筛选到的4株单克隆抗体进行鉴定。ELISA和IFA的结果显示单克隆抗体能与重组的CD2v蛋白反应良好。IPMA结果说明4株单克隆抗体可与病毒产生良好的反应。Western-Blot的结果显示4株单抗均识别线性表位。通过截短CD2v蛋白基因的分段表达,鉴定4株单克隆抗体具体的靶向位点及抗原表位。丙氨酸扫描鉴定出表位的4个关键氨基酸是154SILE157,Dot-Blot和ELISA进行了验证表位的反应性。4.以单克隆抗体为基础的阻断ELISA抗体检测方法的建立通过分子发育树的建立发现CD2v蛋白的氨基酸序列在非洲猪瘟病毒中国流行性毒株中较为单一,并通过对鉴定出的表位序列在非洲猪瘟经典毒株中比对发现该表位在中国流行性毒株中较为保守。再次通过蛋白结构的模拟确定表位位于CD2v蛋白结构表面,具备抗体检测方法建立的潜力。通过棋盘法确定与非洲猪瘟阳性血清的最佳阻断效率高达82%。通过百余组阳性和阴性血清的检测结果建立ROC曲线,AUC值达0.952,证明该系统的可靠性。通过对临床样本的检测,发现符合率为91.47%。且具有良好的特异性和重复性。
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