研究背景及目的:胶质瘤是一种侵袭性的原发性脑肿瘤,以侵袭性生长和早期转移为特征[1]。多形性胶质母细胞瘤（GBM）是所有类型胶质瘤的主要亚型,其生存率一般小于5年[2]。胶质瘤复发率高,治疗效果差,预后差。虽然近几十年来已经发展了手术切除、放疗、化疗和靶向治疗,但胶质瘤特别是GBM的治疗仍不尽如人意。胶质瘤的发展是复杂的,它是通过多基因相互作用和多分子调控来完成的[3]。研究胶质瘤的分子机制,对于探索胶质瘤的有效途径和预后方法具有重要意义。由于lncRNA在各种组织中,尤其是肿瘤组织中的异常表达,已成为研究热点[4,5]。近年来的研究表明,lncRNA参与了人体多种生物学过程,如细胞转录激活、细胞内运输、热休克反应、基因组印迹等[6]。lncRNA与多种恶性肿瘤相关,并以癌基因和促癌因子的形式存在于肿瘤中。lncRNA对胶质瘤增殖和转移的影响也有一些报道。Yan等发现lncRNA Flv CR1-AS1通过竞争性吸附mi R-4731-5p来调节E2F2水平,进一步促进胶质瘤的增殖和转移[7]。Li等人的研究证明,下调LINC00174可抑制胶质瘤细胞对替莫唑胺的耐药,其分子机制是LINC00174可竞争性吸附mi R-138-5p,从而影响SOX9的表达,进一步提高对替莫唑胺的耐药性和胶质瘤细胞的增殖[8]。lncRNAs除了作为ce RNAs通过竞争性吸附mi RNAs进一步调控胶质瘤的生物学功能外,还可以直接与转录因子结合调控基因表达,影响胶质瘤的发生发展。Lv[9]等发现lncRNA PVT1可以通过下调UPF1的表达促进胶质瘤细胞的增殖和迁移。作为一种lncRNA,CRNDE在多种癌症中发挥着重要作用。Sun等报道CRNDE通过调节mi R-29c-3p水平促进成神经管细胞瘤细胞的化疗敏感性[10]。Bai等人证明了CRNDE作为宫颈癌中的一种癌基因,通过竞争性吸附mi R-183[11],增加CCNB1水平,从而促进宫颈癌的发展。这些报告证实了CRNDE在癌症发展中的重要性。对于CRNDE在胶质瘤发展中的作用,Li[12]等人提出,CRNDE作为一种ce RNA,通过调节mi R-136-5P/Bcl-2/Wnt2信号轴促进GBM的进展。Kiang[13]等发现CRNDE促进胶质瘤进展,而这种促进作用是由EGFR信号调节的。然而,lncRNAs在胶质瘤进展中的具体分子机制,特别是lncRNAs与转录因子联合在胶质瘤进展中的调控作用还有待进一步探索。本研究关注CRNDE对胶质瘤的作用,以及CRNDE调控胶质瘤的具体分子机制,特别是能否结合相关转录因子调控下游基因从而影响胶质瘤的发生发展,以及其与临床胶质瘤患者病理特征间的关系。研究方法:通过公共数据库LINCDISEASE、GSE50161、GEPIA以及TCGA和CGGA采用生物信息学方法研究CRNDE和神经胶质瘤发展之间的关系。采用q RT-PCR,western blot和非放射性原位杂交技术（FISH）探讨CRNDE的表达及亚细胞器的定位。为了进一步探讨CRNDE对神经胶质瘤细胞的生物学行为的影响及可能的分子机制CRNDE结合转录因子调控下游基因,在体外进行了了细胞计数试剂盒8（cck-8）测定,集落形成测定,凋亡检测以及Transwell侵袭检测。利用公共数据库LINCDISEASE、GSE50161以及Lnc MAP和Jaspar,预测并证明了可能受CRNDE调控的下游基因ETS1/GPR17。染色质免疫共沉淀（CHIP）用于分析ETS1与GPR17之间的关系。构建胶质瘤颅内异种移植肿瘤模型用于体内实验。以unpaired Student’s two-tailed t-est检验方式检测组间数据差异性。单因素方差分析比较CRNDE在不同WHO分级胶质瘤中的表达水平。卡方检验（Chi-squared test）,以CRNDE的高、低表达为截断值,比较低、高表达组间性别、WHO分级、IDH状态和1p/19q共缺失状态的分布。受试者工作特征（ROC）曲线以检验CRNDE的预测结果。采用Kaplan-Meier法比较CRNDE的低、高表达组间的神经胶质瘤患者的总生存期（OS）。采用Graph Pad Prism 7（Graph Pad Software,Inc）、R v3.4.1（https://www.r-proje ct.org/）和SPSS 20.0（SPSS Inc）进行统计分析。所有实验均独立进行三次或三次以上,P＜0.05被认为是差异有统计学意义。研究结果:第一部分实验:在神经胶质瘤肿瘤样本中CRNDE表达显著上调（1）寻找与胶质瘤相关的DELncRNAs（差异LncRNA）,我们从LINCDISEASE数据库中筛选出142个与胶质瘤相关的lncRNAs（＜0.05）。（2）对GEO数据库中的GSE50161芯片进行limma差异分析,获得37个DELncRNAs（P＜0.05）。取DELncRNAs与胶质瘤相关的LncRNA的交集,得到5个与胶质瘤相关的DELncRNAs,分别为MEG3、CRNDE、XIST、Ag AP2-AS1和LINC01116。（3）通过分析这5个lncRNA在GSE50161芯片的正常样本和胶质瘤肿瘤样本中的表达差异,发现肿瘤样本中CRNDE表达显著上调,且与正常样本相比差异最大（P＜0.05）。（4）由于TCGA数据库中没有GBM的正常组织数据,因此,我们比较了GEPIA数据库中CRNDE的临床表达数据。结果显示,在LGG肿瘤样本中,CRNDE显著上调（P＜0.05）,这与GEO数据库中的CRNDE趋势基本一致。采用q RT-PCR检测HEB细胞和胶质瘤细胞T98G、A172、SNB19和U251中CRNDE水平。结果显示,与HEB细胞相比,CRNDE在4个胶质瘤细胞系中均显著高表达（P＜0.05）。（5）为了在多个数据库中进行验证,在TCGA和CGGA数据库中,我们再次分析了CRNDE与胶质瘤级别之间的关系。结果显示CRNDE与胶质瘤级别正相关（P＜0.05）。生存分析和ROC结果显示,CRNDE可以预测临床胶质瘤患者的预后（P＜0.05）。（6）综合纳入TCGA和CGGA胶质瘤患者的临床数据,我们发现CRNDE的表达与胶质瘤的临床病理特征显著相关（P＜0.05）。第二部分实验:过表达CRNDE调节胶质瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭（1）在T98G和U251细胞中,外源性过表达CRNDE显著促进了细胞的生存能力、生长能力,并抑制了细胞凋亡（P＜0.05）。（2）通过FISH实验和核/浆分离实验证实了CRNDE在肿瘤组织和细胞的细胞核和胞浆中均有表达,且细胞核中的表达水平明显高于胞浆中的表达水平（P＜0.05）。因此CCRNDE可能调控下游转录因子。（3）此外,我们进一步检测了CRNDE过表达对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响。CRNDE过表达后,N-cadherin、Vimentin、MMP9和MMP2表达水平升高,而E-cadherin表达水平降低（P＜0.05）。第三部分实验:CRNDE通过促进ETS1与GPR17启动子区结合来促进GPR17的表达（1）为了探索CRNDE的下游转录因子和调控胶质瘤细胞的靶向m RNA。我们使用lnc MAP数据库预测脑胶质瘤中CRNDE的lncRNA-TF-m RNA三联调控轴,获得30个下游调控转录因子。将这30个转录因子与GSE50161中显著的dem RNA进行交叉,得到了ETS1、MYC、NR3C2和FOXP2四个候选转录因子。通过分析GSE50161芯片中这4个转录因子在正常样本和胶质瘤肿瘤样本中的表达差异,我们发现ETS1在肿瘤样本中表达显著上调,与正常样本相比差异最显著。此外,我们对比GEPIA数据库中ETS1的m RNA表达数据,结果显示ETS1在LGG肿瘤样本中明显上调（P＜0.05）。同时,将GSE50161中的delncRNA与lnc MAP三联体预测结果中的m RNA进行交集,得到GPR17。GPR17在GSE50161芯片和GEPIA数据库临床数据中的表达显示,GPR17在肿瘤样本中呈高表达（P＜0.05）。（2）q RTPCR检测显示,外源性CRNDE过表达会促进癌细胞中GPR17的表达。为了研究ETS1是否与GPR17启动子区域结合以此来调控GPR17的转录,我们使用Jaspar数据库预测ETS1和GPR17启动子区域的结合位点,CHIP和q RT-PCR检测验证ETS1可以结合到GPR17启动子区域。（3）将细胞分为oe-NC+sh-NC组、oe-CRNDE+sh-NC组和oe-CRNDE+sh-ETS1组。分别检测各组GPR17蛋白和m RNA的表达。我们发现,沉默ETS1可以抑制两种胶质瘤细胞中过表达CRNDE的促进作用。这些结果证明了CRNDE-ETS1-GPR17的相互结合作用,提示CRNDE可能通过调控ETS1促进GPR17的表达。第四部分实验:CRNDE调节GPR17调节胶质瘤肿瘤细胞表型（1）在T98G和U251细胞中进行了回复实验。MTT和克隆形成实验结果显示,过表达CRNDE后,细胞活性明显增强（P＜0.05）,抑制GPR17后,CRNDE过表达促进能力明显减弱（P＜0.05）。凋亡结果与增殖结果相反。（2）在细胞迁移和侵袭方面,过表达CRNDE和抑制GPR17会抑制CRNDE过表达对细胞的促进作用。Western blot检测了侵袭和迁移相关蛋白的水平,结果也表明oe-CRNDE+sh-GPR17逆转了过表达CRNDE单独调节蛋白表达的能力（P＜0.05）。第五部分实验:CRNDE促进体内胶质瘤的恶性进展（1）U87细胞中转染了含荧光素酶报告基因的sh-CENDE慢病毒。通过建立U87细胞的颅内胶质瘤模型,在体内进一步证实了CRNDE促进肿瘤恶性进展的作用（P＜0.05）。（2）裸鼠成瘤后的Kaplan-Meier分析和免疫组化显示,CRNDE的下调会延长裸鼠的成活天数（P＜0.05）,抑制胶质瘤的增殖和迁移能力（P＜0.05）,这与体外细胞实验得出的结论一致。研究结论:该研究揭示了CRNDE促进胶质瘤细胞的发育。CRNDE联合ETS1上调GPR17的表达,促进胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭,并阻碍细胞凋亡。CRNDE可以预测临床胶质瘤患者的预后。