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第一部分Cochlin蛋白辅助性T细胞表位的筛选及鉴定
目的:分析小鼠Cochlin蛋白的氨基酸序列,筛选及初步鉴定其辅助性T细胞表位。
材料与方法:
(1)通过Swiss-Prot数据库查找小鼠Cochlin蛋白的全部氨基酸序列；(2)运用DNAMAN,DNASTAR等生物学软件,预测目标蛋白的多个可能含有的Th优势抗原表位；(3)结合主要组织相容性抗原(MHC)Ⅱ类限制性初筛可能的共同基序,初步确定候选抗原表位；(4)通过淋巴细胞增殖实验筛选候选表位肽；(5)将候选表位肽免疫C57BL6小鼠,通过ABR检查筛选有功能的表位肽。
结果:
(1)通过Swiss-Prot数据库查找小鼠Cochlin蛋白的全部氨基酸序列；运用DNAMAN,DNASTAR等生物学软件结合主要组织相容性抗原(MHC)Ⅱ类限制性,预测目标蛋白的多个可能含有的Th优势抗原表位9条:Coch341—355、Coch84-102,Coch532-547,Coch471—490,Coch261-277,Coch506—525,Coch26-40、Coch131-150、Coch290—306。
(2)淋巴细胞增殖实验提示Coch84-102和Coch471-490对脾淋巴细胞具有较强的刺激能力,其余候选表位肽均可一定程度地刺激脾细胞增殖。
(3)初次免疫后2周,Coch84—102和Coch471—490组小鼠ABR阈值在4kHz,8kHz,16kHz,24kHz较免疫前增高(P<0.05),Coch261—277组、Coch506—525组的24kHz,肽段8组、Coch290—306组的4kHz和8kHz较术前增高(P<0.05),其余表位肽段免疫小鼠后ABR阈值与免疫前前比较无差异(P>0.05)。
结论:
Coch84—102(VIGTSGGPVRVYSLPGREN)是Cochlin蛋白针对C57BL6小鼠(H2-b)的Th表位,对脾细胞具有较强的刺激能力,全身免疫后引起轻-中度感音神经性听力下降。
第二部分肽段Coch84—102诱导的AIED模型的听力学及形态学特征
目的:分析肽段Coch84—102诱导的AIED模型的听力学及形态学特征。
材料与方法:
(1)肽段Coch84—102全身免疫C57BL6小鼠,建立AIED模型；(2)综合运用听性脑干反应,畸变产物耳声发射对肽段Coch84-102诱导的AIED模型进行听力学评价；(3)运用半薄切片和超薄切片对肽段Coch84-102诱导的AIED模型在光镜和电镜水平进行形态学观察。
结果:
(1)初次免疫后2周后,实验组小鼠在4kHz,8kHz,16kHz,24kHz处均出现听阈提高(P<0.05),波Ⅱ的潜伏期从免疫前的3.725±0.544ms延长到3.988±0.596ms；而对照组免疫前后小鼠ABR阈值无显著性差异(P>0.05),免疫前的波Ⅲ的潜伏期3.360±0.365ms与免疫后的潜伏期3.259±0.269ms无显著性差异(P>0.05)。实验组动物免疫前后12kHz、14kHz、18kHz、20kHz、22kHz、24kHz、26kHz、和28kHz的原始音的DPOAE信噪比有显著性差异(P<0.05),其中20k、22k、24k、26k、和28k的信噪比均超过10dB SPL。
(2)初次免疫后2周后,小鼠耳蜗半薄切片光镜下观察见内、外毛细胞无缺失,支持细胞存在,Corti’s器的基本构架存在、盖膜、血管纹位置正常,形态无异常变化,无耳蜗内出血征象,未见单核细胞浸润、未见感染征象；部分模型动物可见轻度膜迷路积水,前庭膜稍凸向鼓阶,螺旋神经节细胞呈现正常的形态,但细胞间排列稀疏。
(3)初次免疫后2周后,小鼠听神经及螺旋神经节细胞透射电镜下的病理改变:大部分髓鞘变形、厚薄不均、板层结构松散,崩解断裂呈多层状、空泡状、空网状改变；轴索尚好,但在靠近髓鞘处出现局限性水肿、未见线粒体空化、内室扩张、嵴消失,螺旋神经节细胞内见线粒体减少及空化、嵴消失,高尔基体等结构较紊乱。
结论:
Coch84-102(VIGTSGGPVRVYSLPGREN)全身免疫后C57BL6小鼠出现全频的轻一中度听力损失,高频耳声发射信噪比幅值下降。病理表现为听神经的脱髓鞘病变,螺旋神经节细胞的缺失和损伤,残余螺旋神经节细胞内线粒体减少及空化、嵴消失,高尔基体等结构较紊乱。
第三部分肽段Coch84—102诱导的AIED模型的血清及耳蜗组织匀浆中Th1/Th2/Th17细胞因子的观察
目的:运用CBA技术分析肽段Coch84-102诱导的AIED模型的血清及耳蜗匀浆中细胞因子。
材料与方法:
(1)肽段Coch84—102全身免疫C57BL6小鼠,建立AIED模型；(2)制备检材:AIED模型的静脉血和耳蜗组织匀浆；(3)运用CBA技术分析肽段Coch84—102诱导的AIED模型的血清及耳蜗匀浆中细胞因子含量。
结果:
(1)与对照组相比,实验组血清中IL-6、IFN—γ、TNF的水平均明显增高,IL-2的水平均明显降低,二者有显著性差异(P<0.05)。
(2)实验组与对照组的10％耳蜗组织匀浆液中只检测出IL-6、IFN—γ、IL-17A和IL-10,实验组IL-6水平有显著性提高(P<0.05)。
结论:
在肽段Coch84-102诱导的AIED模型中全身的Th1/Th2网络平衡有向Th1型反应极化的趋势。Th17细胞亚群则并不参与该病理过程。IL-6在该AIED模型中起重要的作用。