海燕内脏脑苷脂的分离纯化及抗肿瘤活性研究

来源 :大连海洋大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:wuzhihot9
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在我国,海星纲种类繁多,资源丰富,其繁殖和适应能力很强,但其食用价值不高,同时是养殖贝类的天敌。海燕是海星纲的一种,其体内含有很多具有生物活性的物质,成为研究的热点。脑苷脂是海燕内脏中一种活性很强的内源性物质,具有调控细胞生长、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗溃疡、免疫调节、神经保护等作用。目前,对脑苷脂的抗肿瘤活性研究已成为国际主流,有望开发成为辅助治疗肿瘤疾病的新药。本文以海燕内脏为原料,采用有机溶剂浸提的方法提取脑苷脂,利用硅胶层析法结合薄层层析法对脑苷脂进行分离纯化,对分离纯化后的脑苷脂进行结构鉴定,以纯化后的脑苷脂为标准品利用高效液相色谱-蒸发光散射检测法对其提取工艺进行优化,并研究其抗肿瘤活性。得到的主要研究结果如下:1、对海燕内脏干粉采用95%乙醇室温下浸提,通过薄层层析法(TCL)鉴定得到脑苷脂粗品,再通过硅胶层析多次对粗脑苷脂进行分离纯化,根据TCL显示结果确定脑苷脂得到纯化。2、采用红外光谱分析对分离纯化后得到的脑苷脂进行结构分析,得到所提取出的脑苷脂含有如下结构:C-H、表明酰胺键的C=O和N-H、C-O、-CH2-以及长脂肪链。通过高分辨质谱分析,得到可能的相对分子质量为790.6439,804.6601和818.6752,与之对应的分子式为C44H87O10N,C45H89O10N和C46H91O10N。3、通过单因素和正交实验优化海燕内脏中提取脑苷脂的条件,结果表明,最佳的提取条件为:室温下,正己烷与乙醇混合比例为2:1(V/V),料液比为1:20(W/V),提取时间为3天,提取次数为2次,此条件下脑苷脂的相对提取率可达到87.67%。4、对分离得到的脑苷脂进行体外抗肿瘤活性实验,MTT结果表明,在剂量为10~400μg/ml范围内,脑苷脂可抑制人肝癌细胞(BEL7402)、人宫颈癌细胞(HeLa)和人乳腺癌细胞(MCF-7)的生长,基本具有时间、剂量的依赖性。人乳腺癌细胞(MCF-7)培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的检测结果与MTT结果基本保持一致,脑苷脂剂量越大,细胞LDH漏出越多,LDH活性越高,说明脑苷脂破坏了MCF-7细胞的细胞膜,使其通透性增加。5、从细胞凋亡的角度研究了脑苷脂的抗肿瘤作用机理。通过细胞形态学观察(倒置显微镜和荧光染色观察)可以看出,脑苷脂可以使MCF-7细胞的细胞数量减少,细胞形状变圆,细胞折光度下降,同时伴随有染色质固缩、细胞核呈致密浓染、出现凋亡小体的凋亡特征。流式细胞仪分析结果表明脑苷脂课诱导MCF-7细胞发生凋亡,使其细胞周期阻滞于G2/M期。线粒体跨膜电位的检测结果显示,脑苷脂使MCF-7细胞的线粒体跨膜电位减小,说明脑苷脂可以通过调节线粒体膜的通透性诱导MCF-7细胞发生凋亡。
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