大脑皮层是大脑半球表面的神经组织部分,并且参与了一系列的高级认知、情绪、感觉和运动,大脑皮层的六层结构是系统进化产生。大脑皮层的异常会导致认知功能障碍且增加精神分裂症和神经系统疾病的敏感性。而大脑皮层的发育也是一个较为复杂的过程,包括增殖、神经元的迁移和神经环路的构筑。哺乳动物大脑皮层是通过“由内向外”的方式发育而来,即最早产生的神经元位于皮质板的下层,而晚出生的神经元越过早出生的神经元位于皮质板上层。Rheb首次发现是在依赖于N-甲基-天冬氨酸受体突触激活的神经元中。伴随着研究的深入,发现Rheb从酵母到人类较为保守,在细胞周期、细胞生长和营养摄取方面都发挥了重要的作用。Rheb只有21kDa,184个氨基酸组成,属于Ras超家族的GTPase。作为一个分子开关调控着很多生物过程,当Rheb与GTP相结合时为激活状态,反之,与GDP相结合为失活状态。Rheb是由N端前169个氨基酸组成GTPase区域和剩下的C端的15个氨基酸组成一个高度可变的CAAX区域组成,而Rheb可以通过CAAX区域锚定于细胞膜上。Rheb受PI3K信号通路调控,包括PKB(又名AKT)和TSC1/2,Rheb调节mTOR复合物并且通过磷酸化4E-BP1和S6控制蛋白合成。Rheb通过调节轴突生长和轴突导向而在中枢神经系统中也扮演着重要的功能;在神经祖细胞中,通过N es-cre条件性敲除Rheb会使S6的磷酸化减少并且使皮层变薄;然而,Rheb敲入的转基因老鼠,表现为髓鞘化增加并且成熟的少突胶质细胞数量增加,伴随着小鼠大脑皮层增厚。不仅如此,Rheb通过分泌脑源性生长因子和胶质源性神经营养因子改善神经退行性疾病包括阿尔兹海默、帕金森和亨廷顿舞蹈症,暗示着Rheb在中枢神经系统中发挥着重要的作用,但是Rheb在胚胎大脑皮层发育中的作用仍未知。本研究构建Rheb超表达(Rhebwt)、干扰(Rhebsh1和Rhebsh2)和突变载体(RhebQ64L,RhebC181S,RhebD60K),通过原代神经元培养和子宫内电击转染技术结合免疫荧光染色和荧光显微镜拍照技术,研究分析了Rheb在小鼠大脑皮层发育中的作用及机制。主要结果如下:1.成功克隆了小鼠Rheb基因并构建了Rheb的超表达载体、干扰载体和点突变载体;2.Rheb的表达量影响神经元的形态和小鼠大脑皮层的发育。在体外原代神经元中超表达Rheb后发现神经元的轴突明显增长,通过在体实验证明Rheb的超表达会抑制神经元的迁移和促进神经元胞体增大、迁移中神经元顶突起的生长和神经元轴突的生长;3.Rheb的活性对于神经元的形态及小鼠大脑皮层的发育也有着非常重要的作用。R heb64,Rheb181和Rheb60为活性依次降低的三个突变体,发现神经元的形态包括胞体大小和轴突的长度均呈现一个逐渐下降的过程,而在体的实验同样呈现相似的结果;4.Rheb调节神经元的形态和小鼠大脑皮层的发育是通过mTOR/S6信号通路并且可被雷帕霉素所抑制。在超表达Rheb后神经元中S6磷酸化水平上升。在利用雷帕霉素处理原代神经元后发现S6的磷酸化下降,并且神经元的胞体、轴突分支、轴突长度都有明显的下降。综上所述,Rheb通过mTOR/S6调节了神经元的形态和小鼠大脑皮层的发育。