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研究背景恶性黑色素瘤(melanoma)具有高度侵袭性,病人预后极差,新的免疫疗法使得治疗出现巨大的进展,但仍有很多患者发生复发转移,开发研究新型有效的免疫疗法刻不容缓。足够的活化的DCs是抗肿瘤免疫反应的最强诱导剂,因此DC疫苗仍然是仍然是当前重要方向和热点之一。肿瘤细胞在特定条件下可以被诱导衰老,高表达和分泌多种免疫刺激性因子,即衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,S ASP),能持续吸引DC、免疫效应细胞的浸润,诱导DC成熟与活化,刺激全身免疫反应。因此,用衰老肿瘤细胞负载DC可能诱导更高水平的DC活化。PD-1/PD-L1信号通路能有效地抑制效应T淋巴细胞的活化、功能和增殖,介导抗原特异性T细胞凋亡和免疫抑制性调节性T细胞(Treg)分化,维持肿瘤抑制性免疫微环境。因此,阻断PD-1/PD-L1通路可以增强效应性T细胞的功能。我们尝试将小鼠恶性黑色素瘤细胞株B16F10的PD-L1基因敲除,经X射线照射诱导衰老后用于负载DC,研究其活化DC的能力,并将DC接种于小鼠体内,研究其抗癌作用。研究目的与方法1、敲除B16F10细胞的PD-L1基因:用CRISPR/Cas9慢病毒转染细胞并小鼠皮下成瘤,行Western Blot和流式检测确定PD-L1表达水平及敲除效果。2、诱导B16F10细胞衰老并检测SASP:分别用6Gy、9 Gy和12 Gy的X射线照射细胞后再分别培养3天、5天和7天,分析各组细胞的SA-β-gal阳性细胞率以确定诱导衰老最佳的照射剂量和培养时间,并行RT-qPCR检测SASP的mRNA表达情况。3、负载DC:分为三组(PD-L1敲除的衰老肿瘤细胞负载DC、衰老肿瘤细胞负载DC和不负载的纯DC),流式检测DC表型和RT-qPCR检测DC的细胞因子的mRNA表达情况以确定DC活化程度。4、小鼠实验:将上述三组DC治疗性和预防性地接种小鼠,观察小鼠肿瘤体积和平均生存时间,对比这三种疫苗对肿瘤的治疗和预防作用。研究结果1、病毒转染后荧光表达均>90%。Western Blot和流式检测显示,相比对照组,实验组的体外培养细胞和瘤组织的PD-L1表达均明显降低;相比体外培养细胞,实验组和对照组的瘤组织的PD-L1表达均明显升高。2、12Gy照射处理后培养7天的细胞数量较前无明显增多,而形态更不规则,细胞体积明显变大,颗粒增多,核浆比降低,且SA-β-gal阳性率最高,p16、p21、IL-12、TNF-α、TNFβ、IFN-γ、CCL5、CXCL9 等的 mRNA 表达量均明显升高,IL-10表达量明显降低。3、流式检测显示,相比空白组,实验组和NC组的CD11c、CD80和CD86的表达均明显升高。RT-qPCR检测显示,相比空白组和NC组,实验组的IL-6、IL-12p40和IFN-γ的mRNA表达明显升高,TGF-β的mRNA表达明显降低。4、在治疗性和预防性实验中,相比空白组和NC组,实验组小鼠的肿瘤体积明显减小,且在预防性实验中实验组小鼠平均生存时间明显延长。研究结论1、本实验用CRISPR/Cas9慢病毒有效地敲除了 B16F10细胞的PD-L1基因,体外培养的B16F10细胞低表达PD-L1,体内肿瘤微环境能诱导细胞表达PD-L1。2、X射线照射能有效诱导B16F10细胞衰老,衰老的细胞高表达免疫刺激性细胞因子和趋化因子。3、用PD-L1敲除的衰老B16F10细胞负载DC,能刺激DC成熟,诱导DC活化并增强其功能。4、PD-L1敲除的衰老B16F10细胞负载的DC疫苗能增强小鼠的抗肿瘤免疫,延长小鼠平均生存时间,对恶性黑色素瘤有一定的治疗和预防作用。