目的：喉癌是头颈部恶性肿瘤中最常见的疾病之一,仍严重威胁人类的生命和健康。喉癌前病变是喉癌变的中心环节,它既可以恶化发展转化为癌,也可以良性逆转为正常细胞。早期发现并进行干预,可以防止其向恶性肿瘤发展。因此,加强对喉癌前病变的研究,深化对癌变机理的认识,已成为头颈肿瘤防治工作的前沿和重点之一。目前研究认为,细胞周期调控受正负两大类因子的调节,正负两类因子之间的平衡被打破,就可能导致肿瘤的发生,细胞周期调控异常是肿瘤发生发展的一个重要前提。这与中医认为疾病是人体阴阳平衡失调所致具有相似之处。祖国医学理论认为痰瘀是导致肿瘤发生发展的重要因素,现代中医临床及导师的前期临床研究均发现采用活血化痰法对喉癌前病变具有较好的治疗作用。但喉癌前病变的中医基本病因病机,及痰瘀在喉癌前病变的发生发展中的作用机制,目前尚缺乏科学的支持与验证。本研究拟在文献研究的基础上,在临床方面对喉癌前病变的中医四诊特征及基本证型分布特点进行研究,为喉前期病变的中医临床辨治提供科学依据,同时也为中医证候的客观化、量化研究提供新的研究途径。在实验方面对喉癌前过程及喉癌前病变痰瘀证的细胞周期调控机制进行研究,深化对喉癌前病变发生发展及痰瘀致癌的机理认识,确立具有较高恶变潜质的中医证候类型。从而为临床上采用活血化痰法阻断逆转喉癌前病变提供理论支撑与实验依据,为中医药对癌前病变的防治提供思路与方向。方法：1.文献研究通过古文献数据库(湖南电子音像出版社的《中华医典》及广东省中医院重点专科中医古籍文献数据库)及现代文献数据库(中国生物医学文献数据库CBMdisc、维普中文生物医学期刊数据库VIP Information、中国知网数据库CNKI、美国NCBI的PubMed、Medline数据库)的查阅挖掘,将相关的古文条文及现代文献报道分类归纳,总结出喉癌前病变的古代在病因病机、辩证分析、施治方法,现代在流行病学、分类诊断、治疗方法等方面的特点与进展。2.临床调研本研究拟通过运用循证医学、临床流行病学等现代科研方法学结合传统医学进行喉前期病变的临床病例的证候信息采集。通过建立流行病学调查表,对214例喉癌前病变的四诊资料集流行病学资料进行采集,采用Epidata3.1软件包建立数据库,双人双输的办法进行数据录入及核对,应用SPSS17.0软件对数据进行统计分析,初步得出喉癌前病变的证候诊断重要指标、证型类型及分布相关情况及流行病学特点。3.实验研究本研究拟利用流式细胞术,检测痰瘀证的喉癌前病变标本中细胞周期因子CyclinD1、Cyclin E、p21、p16蛋白的表达情况,将喉癌前病变阴虚证标本、声带息肉及早期喉癌标本作为证候对照及病情进展对照研究。通过对声带息肉→喉癌前病变→早期喉癌、喉癌前病变、喉癌的不同病理类型及分级组织中的细胞周期因子动态变化的分析,及对痰瘀证、阴虚证癌前病变组织中细胞周期因子表达情况的对比分析,明确喉癌变过程及痰瘀证喉癌前病变的细胞周期调控机制。结果：1.临床研究(1)发病因素：喉癌前病变患者中有长期过度用嗓发音占74.8%、有长期吸烟史者占43.9%,有饮酒习惯者占21.5%,饮食不节者占27.6%,熬夜者占9.3%,感冒者占5.1%。发病因素在三种病理类型中无显著性差异(P值均大于0.05)。(2)性别构成：慢性肥厚性喉炎(非典型增生)中男性60例,女性92例；喉乳头状瘤中男性22例,女性10例；喉角化症(声带白斑)中男性20例,女性10例。三组的男女性别比为0.65：1、2.2：1及2：1,后两者男性均多于女性,性别构成组间差异有统计学意义(P<0.05)。(3)常见症状体征频数：出现频率大于10%的症状依次有：声音嘶哑(声嘶轻度、声嘶中度)、咽异物感、咽干灼热、多言后喉痛、痛处不移、咽痒咳嗽、痰多质粘、清嗓习惯。体征出现频率大于10%的依次有声带闭合欠佳、声带充血肥厚、肿物表面光滑、肿物结节状或乳头状、肿物白斑样改变。舌苔脉象出现频率大于10%的依次有舌质暗或有瘀点、舌苔腻、脉弦、舌苔白、脉滑、舌质红、舌苔黄、舌苔薄、舌胖有齿印、脉细、脉沉。(4)证候聚类分析：根据计算机聚类分析的结果,结合专家意见认为,应聚为4类：工类：声音嘶哑、舌质红、舌苔黄、舌苔腻、脉滑、肿物结节状或乳头状、声带闭合不好。Ⅰ类：清嗓习惯、多言后喉痛、痛处不移、咽异物感、舌胖有齿印、舌质暗或有瘀点、脉沉、声带充血肥厚、肿物光滑。Ⅲ类：声嘶轻、痰多质粘、咽痒咳嗽、舌苔白、脉弦、声带闭合尚好。Ⅳ类：声嘶中重度、咽干灼热、舌苔薄、脉细、肿物白斑样改变。(5)证候诊断的重要指标按主症、次症、舌苔脉象、局部体征依次如下：①湿热困结证主症：声嘶；舌苔脉象：舌质红、舌苔腻、舌苔黄、脉滑；局部体征：声带充血肥厚、声带闭合不好、肿物结节状或乳头状。②气虚痰瘀证主症：声嘶；次症：清嗓习惯、咽异物感、多言后喉痛、痛处不移；舌苔脉象：舌质暗或有瘀点、舌苔腻、舌苔白、脉弦、脉滑、脉沉；局部体征：声带充血肥厚、肿物光滑。③痰浊结聚证主症：声嘶(轻)；次症：痰多质粘、咽瘁咳嗽；舌苔脉象：舌苔白、脉弦；局部体征：声带充血肥厚、肿物表面光滑、声带闭合尚好。④阴虚火旺证主症：声嘶(中重度)；次症：咽干灼热、咽异物感；舌苔脉象：舌质红、舌苔白、舌苔薄、脉细；局部体征：声带充血肥厚、肿物白斑样改变。(6)证型分布情况：Ⅰ类：湿热互结型；Ⅱ类：气虚痰瘀型；Ⅲ类：痰浊困结型；Ⅳ类：阴虚火旺型。其中湿热互结型49例,占22.9%；气虚痰瘀型87例,占40.7%；痰浊困结型23例,占10.7%；阴虚火旺型55例,占25.7%。(7)证候分布的相关因素：①中医证候与性别的关系：在湿热困结证中,男性所占比率较大(67.3%),而在气虚痰瘀证、痰浊结聚证、阴虚火旺证中,女性所占比率较大(分别为58.6%、65.2%、54.5%),统计学上有显著差异(P<0.05)。②中医证候与年龄的关系：喉癌前病变的中年组患者中,气虚痰瘀证占较大比率(42.9%),其他证型相对分散；青年组及老年组各证型均相对分散,统计学上均无意义(P>0.05)。③中医证候与病程的关系：喉癌前病变各证候间的平均发病时间(28.17～37.67个月)相差不大,病程时间呈非正态分布,采用秩和检验,P>0.05,病程在各证候间的差异无统计学意义。④中医证候与病理类型的关系：慢性肥厚性喉炎、喉乳头状瘤多见气虚痰瘀证(分别占40.1%、56.3%),喉白斑角化病多见阴虚火旺证(占33.3%),但各证候间的构成比差异无统计学意义(P>0.05)。⑤中医证型与病因的关系：吸烟、饮酒在湿热困结、气虚痰瘀这两种证型中多见,且有统计学意义(P<0.05)。饮食不节、熬夜在湿热困结证、气虚痰瘀证中多见；用声过度、感冒在气虚痰瘀证、阴虚火旺证中多见,但均没有统计学意义(P>0.05)。⑥中医证型与局部体征的关系：肿物表面光滑多见于气虚痰瘀证中(44.9%),肿物呈结节状或乳头状的多见于湿热困结证(47.1%),肿物白斑样改变多见于阴虚火旺证(68.8%),而且统计学上有显著差异(P=0.001<0.05),因“肿物粗糙质脆易出血”例数较少(3例),暂不做分析。⑦中医证型与声嘶程度的关系：声嘶程度根据VHI-10问卷调查表中的嗓音障碍指数得分而来,各个中医证型均集中在轻度异常与中度异常之间(轻度异常的共50例,中度异常的共150例,正常的共6例,严重失常的共8例),没有统计学意义(P>0.05)。(8)复发率与恶变率本研究对其中137例喉癌前病变进行了随访,共有15例发生复发,4例为声带白斑,4例为喉乳头状瘤,7例为声带息肉伴轻度～中度不典型增生。本研究得到喉癌前病变的复发率为10.95%。其中有6例发生恶变,4例为声带白斑,1例为喉乳头状瘤,1例为声带鳞状上皮中度不典型增生。恶变者均有多年吸烟史饮酒史。本研究得到的喉癌前病变的恶变率为4.38%。2.实验研究(1) CyclinD1的阳性表达率形成声带息肉→喉癌前病变→喉癌阳性强度逐渐增强的梯度现象(分别为13.04%、20.29%、42.42%),但总体上荧光强度较弱；三组分别比较均有统计学差异(P<0.05)。在喉癌前病变组中,CyclinD1在病理分级中的轻度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生的的阳性率表达分别为13.95%、28.57%、31.58%,呈上升趋势,但统计学上没有意义(P>0.05)。CyclinD1在不同病理类型中上皮不典型增生(慢性肥厚性喉炎)、喉乳头状瘤、喉角化症的阳性率表达分别为19.51%、21.05%、22.22%,但三组间差异无统计学意义(P>0.05)。在喉癌组中,不同病理类型高分化、中分化、低分化的CyclinD1的阳性率表达分别为40.00%、41.67%、43.75%；不同病理分级中原位癌、浸润癌的CyclinD1的阳性率表达分别为35.71%、47.37%,两者均呈上升趋势,但统计学上无显著性差异(P>0.05)。(2) CyclinE的阳性表达率形成声带息肉→喉癌前病变→喉癌阳性强度逐渐增强的梯度现象(分别为26.09%、43.48%、93.94%)；且荧光强度较强,统计学上有显著差异(P<0.001)。在喉癌前病变组中,CyclinDl在病理类型中上皮不典型增生(慢性肥厚性喉炎)、喉乳头状瘤、喉角化症的阳性率表达分别为36.59%、52.63%、55.56%,呈上升趋势,但三组比较统计学上亦无意义(P>0.05)。病理分级中轻度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生的三组中CyclinE的阳性率表达分别为25.58%、57.14%、78.95%,也呈上升趋势,统计学上有显著差异(P<0.001)。在喉癌组中,不同病理类型高分化、中分化、低分化的三组中CyclinE的阳性率表达与不同病理分级原位癌、浸润癌中的阳性率表达均较高(80%-100%),且呈上升趋势,但统计学上均无显著差异(P>0.05)。(3)P16的阳性表达率形成声带息肉→喉癌前病变→喉癌阳性强度逐渐递减的现象(分别为60.87%、40.58%、15.15%),统计学上有显著性差异(P<0.001)。在喉癌前病变组中,P16在病理分级中轻度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生的阳性率表达分别为51.16%、42.86%、15.78%,呈逐步下降趋势,统计学上有显著差异(P<0.05)；在病理类型中上皮不典型增生(慢性肥厚性喉炎)、喉乳头状瘤、喉角化症中的阳性率表达分别为41.46%、42.11%、33.33%,三组间差异无统计学意义(P>0.05)。在喉癌组中,不同病理类型高分化、中分化、低分化的P16的阳性率表达分别为20.00%、25.00%、12.50%,不同病理分级原位癌、浸润癌中P16的阳性率表达分别为14.29%%、15.79%,两者在统计学上均无显著性差异(P>0.05)。(4)P21的阳性表达率形成声带息肉→喉癌前病变→喉癌阳性强度逐渐递减的现象(分别为47.83%、26.09%、24.24%)。但没有统计学意义(P>0.05)。在喉癌前病变组中,P21在病理类型上皮不典型增生(慢性肥厚性喉炎)、喉乳头状瘤、喉角化症中的阳性率表达分别为26.83%、26.32%、22.22%；在病理分级中轻度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生的P21的阳性率表达分别为27.91%、28.57%、21.05%,呈下降趋势,但两者在统计学上均无差异(P>0.05)。在喉癌组中,不同病理类型高分化、中分化、低分化的P21的阳性率表达相差不大(分别为20.00%、25.00%、18.75%),不同病理分级原位癌、浸润癌中P21的阳性率表达分别为21.43%、21.05%,统计学上亦均无差异(P>0.05)。(5)CyclinD1、CyclinE在痰瘀证中的阳性率表达相对较高(分别为23.40%、46.81%),在阴虚证中的阳性率表达相对较低(分别为9.09%、36.36%),但两两比较无统计学意义(P>0.05)。P16在痰瘀证中的阳性率表达相对较低(34.04%),在阴虚证中的阳性表达相对较高(45.0%),但两组间差异仍无统计学意义(P>0.05)。然而P21在痰瘀证与阴虚证中的阳性率表达则无明显差异(分别为27.66%、23.0%),P>0.05。结论：1.喉癌前病变的流行病学特点(1)喉癌前病变的危险因素依次有用嗓不当、吸烟、饮酒、饮食不节、熬夜、感冒等。(2)喉癌前病变的性别构成在喉乳头状瘤与喉白斑角化病中男女之比约为2：1；在慢性肥厚性喉炎中的比例则为0.65：1。(3)喉癌前病变的复发率为10.95%,喉癌前病变的恶变率为4.38%。2.喉癌前病变的中医病因病机、证候特征及分布特点(1)中医的病因病机主要有：外因为吸烟喝酒、外感之湿热毒邪；内因则为饮食不节损伤脾胃致痰浊结聚,过度用声、熬夜致劳累过度致正气虚损、气阴两伤。(2)喉癌前病变的中医证型按由大至小的比例分布情况,主要分为气虚痰瘀型、阴虚火旺型、湿热互结型、痰浊困结型,共4类。其证候诊断的重要指标特点可见结果部分内容(略)。(3)中医证型分布相关性分析中,男性多见湿热困结证,女性多见气虚痰瘀证、痰浊结聚证、阴虚火旺证；吸烟史、饮酒史多见于湿热困结型和气虚痰瘀型两种证型；喉癌前病变的局部体征对中医证型分布有显著差异(略)。病理类型、年龄、病程、声嘶程度对喉癌前病变的中医证型分布无明显影响。3.喉癌变过程及中医证型的细胞周期调控机制(1) CyclinD1、CyclinE在声带息肉→喉癌前病变→喉癌组、喉癌前病变的轻度不典型增生→中度不典型增生→重度不典型增生组中的表达均呈现逐渐增强的梯度现象,统计学上特别是第一组均有显著差异,提示正性调控因子CyclinDl及CyclinE的过度表达,导致细胞周期加快,肿瘤恶性增生。CyclinDl及CyclinE在喉癌的不同分化类型及病理分级中,尚未呈现明显差异,可能与标本量少有关。总体上CyclinE在恶性程度高的病变组织中的表达较CyclinDl高,CyclinE是否比CyclinDl在G1/S限制点上发挥更大的促进作用,仍需进一步深入研究。(2)P16、P21在声带息肉→喉癌前病变→喉癌组、喉癌前病变的轻度不典型增生→中度不典型增生→重度不典型增生组中,阳性率表达均呈逐渐减弱的梯度现象,但只有P16在统计学上有显著性差异。提示P16作为抑癌基因,在抑制CDK4/CDK6介导的Rb磷酸化,阻止不正常细胞在G1/S的进程上起重要的作用。而在喉癌的不同分化类型、病理分级中,P16、P21的阳性率表达均较低,但组间比较仍无显著差异,仍考虑与样本量有限相关。(3) CyclinD1、CyclinE在痰瘀证中的阳性率表达相对较高,在阴虚证中的阳性率表达相对较低；P16在痰瘀证中的阳性率表达相对较低,在阴虚证中的阳性表达相对较高；P21在痰瘀证与阴虚证中的阳性率表达则相反。但以上表达的组间差异均无统计学意义。提示在痰瘀致病的过程中,正性调控因子CyclinD1、CyclinE的高表达,负性调控因子P16的低表达导致细胞周期调控异常可能是其分子生物学机制,但仍需进一步扩大样本量深入研究以验证。4.不足与展望虽然本研究仍存在许多不足,如研究资料有限,包括样本量不够、非多中心研究；研究设计有所欠缺,包括临床调研表内容及实验研究标本的采集方法选择等。现有的研究结果暂未能为中医辩证及其相关细胞分子生物作用机制提供明确依据,仍必须继续在今后的临床及实验实践中逐步修改和完善。