背景缺血性脑血管病（ischemic cerebrovascular disease，ICVD）作为临床常见的危急重病之一，其高致残率及高死亡率已严重威胁人类健康。目前，大量的研究集中于挽救和改善神经元存活和功能恢复，而有关脑缺血后脑微血管再生、微循环重建等方面，较少引起关注。在脑缺血早期，通过血管生成以建立新的血管网，恢复缺血区的血供，将能挽救濒死的神经元，促进神经功能的恢复。血管新生可通过多种蛋白因子或信号转导通路的调节，而PI3K/AKT作为细胞内重要的信号转导通路，常作为改善脑血管病患者预后的一个重要的治疗靶点。脑缺血后自身“代偿性血管再生”为缺血性脑血管病的病理机制研究提供了新的思路，但由于这种自然代偿过程缓慢，且产生的侧枝循环常灌注不足[1]，不能挽救濒死的神经元而导致神经功能的损害，因此，选取有效的药物或其他干预手段促进缺血后血管生成显得尤为重要。近年来，关于中医药治疗缺血性脑血管病的研究较多，且已获得一定的疗效，虽然其作用机制相当复杂，但促进血管再生可能是其重要作用机制之一。而本课题前期实验已证实，中药复方脑脉通对缺血再灌注损伤有显著的保护作用，促进缺血区血管新生是其保护脑损伤的重要途径。因此，本课题在以前研究的基础上，从p-Akt1及FⅧR:Ag表达变化方面探讨老龄大鼠脑缺血/再灌注脑微血管生成机制，并以此为切入点进一步阐释中药复方脑脉通对微血管生成的促进作用及其可能的作用机制。目的1以SD大鼠为研究对象，采用线栓法制备局灶性大脑中动脉脑缺血动物模型，观察脑缺血再灌注损伤后青年和老龄大鼠脑缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d行为学改变及脑血管超微结构变化；研究脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用。2采用免疫组织化学方法检测青年和老龄大鼠脑缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d脑微血管p-Akt1表达变化；研究脑脉通对老龄大鼠脑缺血再灌注损伤p-Akt1表达变化的影响。3采用免疫组织化学方法检测青年和老龄大鼠脑缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d脑微血管FⅧR:Ag表达变化；研究脑脉通对老龄大鼠脑缺血再灌注损伤FⅧR:Ag表达变化的影响。方法1采用MCAO线栓法复制大鼠局灶性脑缺血3h，再灌注24h、3d、6d、12d动物模型，观察脑缺血3h，再灌注1d、3d、6d、12d神经功能评分、并通过电镜观察各组大鼠在脑I/R后不同时间点脑组织超微结构变化，以进一步探讨脑脉通对老龄大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织病理改变的影响。2采用MCAO线栓法复制大鼠局灶性脑缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d动物模型，运用免疫组织化学方法比较各组大鼠在脑缺血3h再灌注1d、3d、6d、12d后脑组织p-Akt1的表达变化，观察脑脉通对老龄大鼠缺血再灌注后p-Akt1表达变化的影响。3采用MCAO线栓法复制大鼠局灶性脑缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d动物模型，运用免疫组织化学方法比较各组大鼠在脑缺血3h再灌注1d、3d、6d、12d后脑组织FⅧ:Ag的表达变化，观察脑脉通对老龄大鼠缺血再灌注后FⅧ:Ag表达变化的影响。结果1老龄大鼠脑缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion，I/R）后神经功能评分、脑组织超微结构变化及脑脉通对其表达的影响1.1各组大鼠脑缺血后神经功能综合评分：青年模型组各时间点大鼠神经功能评分均低于青年假手术组（P<0.01）。青年模型组I/R1d、3d、6d、12d组神经功能评分均低于青年模型组I3h（P<0.01）；青年模型组I/R3d、6d神经功能评分低于青年模型组I/R1d（P<0.01），青年模型组I/R12d神经功能评分高于青年模型组I/R1d（P<0.01）；青年模型组I/R6d神经功能评分低于青年模型组I/R3d（P<0.01），青年模型组I/R12d神经功能评分高于青年模型组I/R3d（P<0.01）；青年模型组I/R12d神经功能评分高于青年模型组I/R6d（P<0.01）。老龄模型组各时间点大鼠神经功能评分均低于老龄假手术组（P<0.01）。老龄模型组I/R1d、3d、6d、12d组神经功能评分均低于老龄模型组I3h（P<0.01）；老龄模型组I/R3d、6d神经功能评分低于老龄模型组I/R1d（P<0.01），老龄模型组I/R12d神经功能评分高于老龄模型组I/R1d（P<0.01）；老龄模型组I/R6d神经功能评分低于老龄模型组I/R3d（P<0.01），老龄模型组I/R12d神经功能评分高于老龄模型组I/R3d（P<0.01）；老龄模型组I/R12d神经功能评分高于老龄模型组I/R6d（P<0.01）。与老龄模型组相同时间点比较，脑脉通组及尼莫地平组神经功能障碍评分均增高（P<0.01，P<0.05）。脑脉通组I/R1d、3d、6d、12d组神经功能评分均低于脑脉通组I3h（P<0.01）；脑脉通组I/R3d、6d神经功能评分低于脑脉通组I/R1d（P<0.01），脑脉通组I/R12d组神经功能评分高于脑脉通组I/R1d（P<0.01）；脑脉通组I/R6d组神经功能评分低于脑脉通组I/R3d（P<0.01），脑脉通组I/R12d组神经功能评分高于脑脉通组I/R3d（P<0.01）；脑脉通组I/R12d神经功能评分高于脑脉通组I/R6d（P<0.01）。与尼莫地平组相同时间点比较，脑脉通组I/R1d、I/R3d、I/R6d神经功能障碍评分均增加（P<0.01，P<0.05）。1.2各组大鼠脑缺血后脑组织超微结构的变化青年假手术组大鼠脑皮质微血管结构完整，基膜及管周均无水肿。血管基底膜连续完整，无溶解、断裂、卷曲、脱落、缺失等。内皮细胞胞浆正常，无水肿。线粒体结构清淅，无肿胀、断裂。粗面内质网结构正常。青年模型组可见管周围轻度水肿（I3h、I/R6d、 I/R12d，照片2、5、6）、中重度水肿（I/R1d、 I/R3d，照片3、4）。内皮细胞线粒体可轻度水肿（I3h、I/R6d、I/R12d，照片2、5、6）。基底膜部分扭曲，基底膜部分水肿（I/R1d、I/R3d，照片3、4），血管基底膜溶解、断裂、缺损（I/R1d、I/R3d、I/R6d，照片3-5）。老龄假手术组大鼠脑皮质微血管结构完整，基膜及管周无明显水肿，血管基底膜连续完整，无溶解、断裂、卷曲、脱落、缺失等（照片7）。老龄模型组可见管周围轻度水肿（I/R6d、I/R12d，照片11、12）、中重度水肿（I3h、I/R1d、I/R3d，尤以I/R3d最重，照片8-10）。内皮细胞线粒体水肿（I3h、I/R1d、I/R6d，照片8、9、11）。血管基底膜溶解、断裂、缺损（I3h、I/R1d、I/R3d、I/R6d，照片8-11）。脑脉通组可见管周围轻度水肿（I/R6d，照片16），内皮细胞线粒体水肿（I3h、I/R1d、I/R6d，照片13、14、16）。尼莫地平组内皮细胞线粒体水肿（I3h、I/R1d、I/R3d、I/R6d、I/R12d，尤以I/R12d最重，照片18-22）。2老龄大鼠脑缺血/再灌注损伤p-Akt1表达变化及脑脉通对其表达的影响青年模型组各时间点大鼠p-Akt1表达水平强于青年假手术组（P<0.01）。青年模型组I/R1d、6d表达强于青年模型组I3h（P<0.01），青年模型组I/R3d、12d表达弱于青年模型组I3h（P<0.01）；青年模型组I/R6d表达强于青年模型组I/R1d（P<0.01），青年模型组I/R3d、12d表达弱于青年模型组I/R1d（P<0.01）；青年模型组I/R6d表达强于青年模型组I/R3d（P<0.01）；青年模型组I/R12d表达弱于青年模型组I/R6d（P<0.01）。与青年模型组相同时间点比较，老龄模型组p-Akt1表达均减弱（P<0.01）。老龄模型组各时间点大鼠p-Akt1表达水平强于老龄假手术组（P<0.01）。老龄模型组I/R1d、6d表达强于老龄模型组I3h（P<0.01），老龄模型组I/R12d表达弱于老龄模型组I3h（P<0.01）；老龄模型组I/R6d表达强于老龄模型组I/R1d（P<0.01），老龄模型组I/R3d、12d表达弱于老龄模型组I/R1d（P<0.01）；老龄模型组I/R6d表达强于老龄模型组I/R3d（P<0.01），老龄模型组I/R12d表达弱于老龄模型组I/R3d（P<0.01）；老龄模型组I/R12d表达弱于老龄模型组I/R6d（P<0.01）。与老龄模型组相同时间点比较，脑脉通组及尼莫地平组p-Akt1表达水平增强（P<0.01，P<0.05）。脑脉通组I/R1d、3d、6d、12d表达均强于脑脉通组I3h（P<0.01）；脑脉通组I/R6d表达强于脑脉通组I/R1d（P<0.01），脑脉通组I/R3d、12d表达弱于脑脉通组I/R1d（P<0.01）；脑脉通组I/R6d、12d表达强于脑脉通组I/R3d（P<0.01，P<0.05）；脑脉通组I/R12d表达弱于脑脉通组I/R6d（P<0.01）。3老龄大鼠脑缺血/再灌注损伤F Ⅷ R:Ag表达变化及脑脉通对其表达的影响青年模型组各时间点大鼠FⅧR:Ag表达水平均强于青年假手术组（P<0.01）。青年模型组I/R3d、6d表达均强于青年模型组I3h（P<0.01，P<0.05），青年模型组I/R1d表达弱于青年模型组I3h（P<0.01）；青年模型组I/R3d、6d、12d表达均强于青年模型组I/R1d（P<0.01）；青年模型组I/R6d表达强于青年模型组I/R3d（P<0.01）青年模型组I/R12d表达弱于青年模型组I/R3d（P<0.01，P<0.05）；青年模型组I/R12d表达弱于青年模型组I/R6d（P<0.01）。与青年模型组相同时间点比较，老龄模型组FⅧR:Ag表达水平降低（P<0.01）。老龄模型组各时间点表达均较老龄假手术组增强（P<0.01）。老龄模型组I/R3d、6d大鼠表达强于老龄模型组I3h（P<0.01），老龄模型组I/R1d表达弱于老龄模型组I3h（P<0.01）；老龄模型组I/R3d、6d、12d表达强于老龄模型组I/R1d（P<0.01）；老龄模型组I/R6d表达强于老龄模型组I/R3d（P<0.01），老龄模型组I/R12d表达弱于老龄模型组I/R3d（P<0.01）；老龄模型组I/R12d表达弱于老龄模型组I/R6d（P<0.01）。脑脉通组及尼莫地平组各时间点大鼠FⅧR:Ag表达水平均强于老龄模型组（P<0.01）。脑脉通组I/R3d、6d、12d表达均强于脑脉通组I3h（P<0.01），脑脉通组I/R1d表达弱于脑脉通组I3h（P<0.01）；脑脉通组I/R3d、6d、12d表达强于脑脉通组I/R1d（P<0.01）；脑脉通组I/R6d表达强于脑脉通组I/R3d（P<0.01）；脑脉通组I/R12表达弱于脑脉通组I/R3d（P<0.01）。结论1通过对脑缺血/再灌注损伤后老龄大鼠神经功能症状及脑组织超微结构变化的观察，与青年模型组相同时间点比较，老龄模型组大鼠脑I/R后组织损伤出现较早，损伤程度较重，且恢复较慢。而随着大鼠缺血再灌注时间的延长，各组大鼠均可见不同程度的组织损伤及修复，尤以脑脉通组大鼠脑组织损伤程度最轻，修复最快。2PI3K/AKT信号转导通路激活后，可诱导Akt1磷酸化表达，促进血管新生。而脑脉通可能通过激活PI3K/AKT信号转导通路的，上调p-Akt1表达增加，参与血管再生。3FⅧR:Ag多在新生血管大量表达，且其表达的强度与血管新生的程度呈正相关。脑脉通可刺激内皮细胞释放FⅧR:Ag表达增多，提示脑脉通可促进脑缺血后脑微血管生成。