论文部分内容阅读
远缘杂交是将两个亲缘关系比较远的物种进行杂交,杂交后代通常具有父母双亲的优良性状,同时还可以增加后代基因重组和突变的频率。在红鲫(Red crucian carp,RCC,♀,2n=100)和团头鲂(Megalobrama amblycephala,BSB,♂,2n=48)的远缘杂交研究中,其中部分F1的雌性和雄性的个体分别能够产生二倍体卵子(2n=100)和二倍体精子(2n=100),筛选出这样的雌雄个体进行自交,在F2中形成了雌性和雄性均可育的同源四倍体鱼(4n=200)群体,并对F2进行繁殖育种,经过不断的传代,最终获得了具有稳定遗传特性的同源四倍体鱼的杂交品系(F2-F13)。本文选取雄性的同源四倍体鱼(F8,4n=200)与雌性的红鲫(2n=100)进行杂交,获得了同源三倍体鱼(3n=150)。同时,将同源四倍体鱼(F8,♂,4n=200)和鲤鱼(cyprinuo carpio L,CC,♀,2n=100)进行杂交,杂交后代为异源三倍体鱼(3n=150)。在繁殖期,雌性的同源三倍体鱼和红鲫杂交可以产生二倍体和四倍体的后代;同源三倍体鱼的雌核发育也可以产生存活的后代,这都证明了雌性的同源三倍体鱼是可育的。以前的研究普遍认为,在减数分裂时期,由于三倍体鱼的同源染色体配对行为发生紊乱,无法产生稳定的配子,所以都是不可育的,但是我们获得的雌性的同源三倍体鱼却是可育的,这为探究三倍体鱼的能育性提供了良好的实验材料。为了探究三倍体鱼可育的分子机制,本文比较分析了雌性的同源三倍体鱼和雌性的异源三倍体鱼的生殖特性。本研究的主要内容有:1.分别选取一年到两年之间的、雌性的同源和异源三倍体鱼(两年性成熟),对它们的卵巢组织进行连续组织切片观察,结果显示,在非繁殖期,两种鱼的卵巢组织切片中几乎所有的卵母细胞都处于I时相时期,两者的发育程度没有差别,还无法判断鱼类的育性。在繁殖期,在同源三倍体鱼的卵巢组织切片中,大量分布II、III、IV时相时期的卵母细胞,卵母细胞发育正常。但是,异源三倍体鱼的卵巢组织切片中,几乎所有细胞还是停留在I时相时期,这些细胞没有看到卵黄的形成,还有极少数已经退化的II,III时相时期的细胞,这些特征都说明异源三倍体鱼的卵巢发育不正常。2.选取2龄的、雌性的同源和异源三倍体鱼卵巢组织进行转录组测序。分别获得了 46,869,254条和43,654,554条clean reads,通过序列组装后分别得到了 137,083个和99,836个unigenes,经过转录组数据库注释后分别得到了 33,692个和28,755个注释的基因。两种鱼的转录组进行差异分析结果表明,在同源三倍体鱼中差异表达的基因有11,556个,6,729个基因在异源三倍体鱼中差异表达。同时,与异源三倍体鱼比较,有8,311个基因在同源三倍体鱼中高表达,7,382个基因低表达,230个基因在同源三倍体鱼中特异表达,65个基因在异源三倍体鱼中特异表达。3.通过对转录本测序数据中的KEGG、COG、NR数据库的比对分析,结果发现两种鱼的转录组中表达基因在功能分类上并没有明显差别,部分基因的表达差异和基因结构差异可能是引起两种鱼生殖特性不同的关键。我们筛选出了 16个与卵巢发育相关的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),10 个与减数分裂相关的DEGs。通过分子克隆的方法获得了 2个基因的cDNA的部分序列,结果显示在碱基序列和氨基酸序列上存在片段的缺失,单个碱基突变,碱基的突变导致翻译的氨基酸也不一样,这些结果证明了基因的结构和功能相适应。通过RT-PCR和qPCR技术对这8个具有代表性的卵巢发育相关的DEGs进行验证,其中在同源三倍体鱼的卵巢中表达水平上调的基因有PAZ,Lhx8,cdc2,nfr,stAR,在异源三倍体鱼的卵巢组织中表达上调的基因有Clq,cdc28,pla2。对这些基因的功能进行分析,发现它们或与初级卵母细胞的发育,类固醇激素的合成,卵子形成,促进排卵等有关。同时,通过qRT-PCR验证6个与减数分裂相关的具有代表性的DEGs,结果显示大部分的基因都在同源三倍体鱼卵巢中表达上调。综上所述,雌性的同源三倍体鱼可育的分子机制或许与卵巢发育相关的部分基因的表达差异和基因的结构有关。同时,减数分裂相关的基因在同源三倍体鱼的卵巢中表达上调,推测其或许会减少同源染色体在减数分裂时期配对紊乱对鱼类育性的影响。本研究通过组织水平和基因水平去探究同源三倍体鱼的育性问题,这为以后研究三倍体鱼类育性的分子机制积累数据并提供参考,同时,对于鱼类的繁殖和遗传育种奠定了理论基础。