第一部分小鼠颈部异位心脏移植模型的建立和两种手术方法的比较目的分别用套管法和缝合法构建小鼠颈部异位心脏移植模型，比较两者的优劣性，并为下一步进行心脏移植免疫学研究奠定基础。方法实验分同种异体移植组（cardiac allograft，CaA）（n=39）和同系移植组（cardiac isograft，CaI）（n=25），同种异体移植用缝合法吻合，在杂交系昆明小鼠间进行；同系移植用套管法吻合，在近交系BALB／C小鼠间进行。正式手术64次。用硬膜外麻醉导管拉制成血管套管用于术中。手术在10倍手术显微镜下单人操作；供受体交替手术，套管法先制作受体的动脉和静脉套管，缝合法只需暴露好动静脉即可，然后切取供心，最后分别用Cuff技术和缝合技术将受体颈总动脉（cervical common artery，CMA）和颈外静脉（external jugular vein，EJV）与供心升主动脉和肺动脉吻合。结果分别行正式实验39次和25次，术后100％复跳，3天存活率分别为72％（28／39）、92％（23／25），供心缺血时间均少于30分钟。同种异体移植心存活期平均8.3±1.3天，病理检查可见典型排斥反应征象，同系移植心平均存活期超过三月（存活超过三月后即处死不再观察），病理检查未见明显心肌损害。结论用套管法建立小鼠异位心脏移植模型，明显降低了手术难度，具有手术创伤小，供心缺血时间短，成功率高等优点，尤其适合初学者。第二部分供体髓源性未成熟树突状细胞的体外培养和生物学特性的鉴定目的：探讨小鼠骨髓源性未成熟DC的培养方法，并初步观察其生物学特性。方法：无菌条件下分离小鼠骨髓细胞，红细胞裂解液去除红细胞，用RMPI1640全培养液按2×10⁶／ml的密度进行培养，按加入细胞因子GM-CSF的剂量，分为高剂量组（200U／ml）和低剂量组（50U／ml），每3天换液1次，培养时间为12-15天，培养期间光镜下对其进行形态学观察，用流式细胞术（fluorescence-activated cell sorting，FACS）进行细胞鉴定并检测其细胞表型，混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction，MLR）检测其在体外刺激同种异体T细胞增殖的能力，RT-PCR检测不同剂量GM-CSF培养的DC细胞的IL-10mRNA和TGF-βmRNA的表达水平。结果：高剂量GM-CSF培养出的DC为成熟DC和未成熟DC的混合体，表型为CD11c⁺，CD25^±，CD80⁺，CD86⁺，MHCⅡ^hi，体外高水平刺激同种异体T细胞的分化增殖；而低剂量GM-CSF培养出的DC为较单纯的未成熟DC，表型为CD11c⁺，CD25^-，CD80^-，CD86^-，MHCⅡ^low，MLR不能有效刺激活化同种异体T细胞增殖（低反应），其IL-10mRNA表达水平明显高于高剂量组DC，TGF-βmRNA在两组细胞中的表达无明显差异。结论：低剂量GM-CSF可以培养出的性质和功能相对稳定的DC，其低水平表达MHCⅡ分子，不表达协同刺激分子CD80和CD86，体外不能有效刺激同种异体T细胞增殖，但高水平表达IL-10 mRNA，提示其可能自身高水平分泌IL-10，这也许是其成熟障碍的原因。第三部分小鼠TGF-β真核生物表达载体的构建与鉴定目的：构建并鉴定小鼠TGF-β真核生物的表达载体方法：抽取供体BALB／c小鼠骨髓，提取总细胞mRNA，RT-PCR技术扩增小鼠TGF-β结构基因序列，利用基因工程技术将该基因片段与质粒PCDNA3.1相连接，构建PCDNA3.1-TGF-β重组质粒，低温氯化钙法将重组质粒转化进入大肠杆菌获得转化菌株，从阳性转化菌株提取质粒进行酶切鉴定并测序分析。结果：RT-PCR获得了与预期产物大小一致的DNA片段，从大肠杆菌转化阳性菌株提取重组质粒，经限制性内切酶酶切鉴定与预期结果相符，DNA测序结果与Genebank报道一致。结论：成功地构建了小鼠TGF-β真核表达载体，含完整的小鼠TGF-β基因序列。第四部分转染TGF-β基因的未成熟树突状细胞诱导心脏移植免疫耐受的实验研究目的：观察术前输注转染TGF-β基因的未成熟树突状细胞（DC）对同种异体移植心生存时间的影响方法：采用低剂量GM-CSF的方法，培养出BALB／c小鼠骨髓源性的未成熟DC，借助脂质体（lipidosome，Lip）将重组质粒TGF-β-pcDNA3.1转染进入供体来源的未成熟DC用于实验，实验分2组：转染DC组vs单纯DC组；第3步加设直接移植组（输注生理盐水干预）作为空白对照。实验方案如下：①RT-PCR检测两组DC的TGF-βmRNA表达水平；②混合淋巴细胞反应（MLR）检测两组DC在体外刺激同种异体T细胞增殖的能力；③心脏移植术前一周分别输注单纯DC和转染TGF-β基因的未成熟DC各约1.0×10⁶个，本步骤第3组则直接移植作为空白对照组，观察其对同种异体移植心生存时间的影响，并于手术后第7天取移植心脏检测排斥反应。结果①RT-PCR检测TGF-β的表达水平：转染DC组TGF-β的表达水平明显高于单纯DC组；②混合淋巴细胞反应（MLR）：转染TGF-β的未成熟DC在体外不能刺激同种异体T细胞增殖，单纯未成熟DC在体外低水平刺激同种异体T细胞增殖；③对同种异体移植心生存时间的影响：转染DC组移植心存活时间显著长于单纯DC组（分别为22.3±3.3d vs 15±2.2d），两者均长于空白对照组（7.1±0.8天），移植心病理切片显示转染DC组移植心出现极轻度排斥反应（Stanford 0～1级），而单纯DC组移植心出现轻度排斥反应（Stanford 1～2级），空白对照组出现较重排斥反应（Stanford 3～4级）。结论术前输注低剂量GM-CSF培养出的供体（近交系）未成熟骨髓源性DC，自身仅低水平表达TGF-βmRNA，体外低水平刺激同种异体T淋巴细胞增殖反应，和空白对照组比较可显著延长移植心的存活时间；转染TGF-β基因后，TGF-βmRNA的表达水平明显提高，进一步延长了移植心的存活时间，体外刺激同种异体T淋巴细胞增殖反应的能力进一步降低，这可能是诱导受体Th1／Th2免疫偏移（immune deviation，ID）的重要原因。