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高温引起的雄性不育现象在植物中普遍存在,同时也是影响棉花蕾铃脱落的重要因素。在全球气候变暖的影响下,频繁出现的持续高温天气对棉花产量及品质均有极大影响。持续的高温会引起棉花雄性器官的发育异常,主要表现为:花药不开裂,花丝缩短和小孢子败育等。虽然高温诱导的棉花雄性不育现象早已发现,然而其形成的分子机制和调控网络尚不清楚。目前,棉花生产上所用的大多数品种对持续高温的耐受性都较弱,耐高温的棉花品种相对较少,因此培育耐高温的棉花品种具有重要的应用价值。本研究通过small RNA测序对高温耐受型棉花品系‘84021’和高温敏感型棉花品系‘H05’高温处理前后的不同发育时期的花药进行分析,发现了大量参与高温响应的small RNA,并对其中的miRNA进行进一步的研究。首先筛选获得参与高温胁迫影响棉花花药发育的miRNA,并用qRT-PCR对测序获得的数据进行验证,同时进行miRNA的表达分析。随后,利用降解组测序技术,进行miRNA靶标的鉴定,以获得miRNA的靶标。为了研究miRNA在高温胁迫引起的棉花雄性不育中的作用,本研究对响应高温胁迫的两个miRNA(miR157和miR160)进行棉花转基因,并鉴定其在高温胁迫下棉花花药发育中的功能。本研究取得的主要研究结果如下:1、在正常温度条件下,幼嫩的棉花花蕾(3-4 mm)发育到开花所需要的时间大约在25天左右。棉花花药的四分体时期(TS)大约经历2-3天,距离开花的时间为17-19天;绒毡层降解时期(TDS)大约需要1周,距离开花的时间为6-13天;花药开裂期(ADS)持续2天,且距离开花只有2天。花药发育在绒毡层降解完成后,花蕾长度有1天短暂的停滞期,随后花蕾长度快速伸长,并且花药发育会在1-2天进入花药开裂期。由于敏感型棉花品系在高温处理大约1周左右出现雄性败育的表型,因此通过花药发育时期与开花时间的关系可以推测出花药发育对高温敏感的时期可能是四分体时期和绒毡层降解期。2、利用small RNA测序技术对正常温度和高温胁迫下高温耐受型棉花品系‘84021’和高温敏感型棉花品系‘H05’的2个不同发育时期(TS和TDS)的16个花药样品(包含2个生物学重复)进行small RNA分析。从测序结果中共鉴定到112个已知的miRNA和270个新发现的miRNA,通过进一步筛选获得27个表达丰度较高且响应高温胁迫的miRNA。随后通过qRT-PCR对small RNA测序的结果进行验证,并在‘84021’和‘H05’中对部分候选miRNA进行表达分析,通过测序及表达验证,筛选获得了一些参与高温响应以及花药发育的miRNA,如miR156/157,miR160,miR167,miR172等,为后续研究miRNA在花药发育及高温响应中的作用提供数据支持。3、利用降解组测序技术,对‘84021’和‘H05’在正常温度和高温条件下的4个花药降解组文库进行miRNA靶标的鉴定,共获得76个miRNA的347个靶标基因,包含528个靶标剪切位点。随后通过RLM-RACE以及qRT-PCR的方法对降解组鉴定到的靶标剪切位点以及靶标的表达量进行验证。结果显示经过miRNA可以对降解组中鉴定到的相应靶标进行剪切,同时表达分析也显示大多miRNA的表达与靶标的表达呈现相反的趋势。由此,鉴定到大量与花药发育及高温响应相关的miRNA靶标,为棉花花药发育及高温响应中miRNA的功能鉴定提供了良好的基础。4、本研究发现在棉花中超量表达miR160抑制了花药中miR160靶标基因ARF10和ARF17的表达,增加了棉花花药开裂过程对高温的敏感性,具体表现为超表达miR160棉花株系的花药在高温胁迫5天时出现花药不开裂但花粉活性正常的表型。为了进一步证明miR160在生长素信号调控高温胁迫影响花药育性中的功能,本研究在高温条件下进行了外源生长素处理的实验。研究发现,在高温条件下外源生长素可以引起棉花的雄性不育,同时qRT-PCR检测结果也发现miR160及其靶标的表达均受高温和外源生长素喷施的影响,因此证明miR160的表达同时受到高温和生长素信号的调控。进一步研究表明,在正常或者高温条件下,胼胝质合成的关键基因Cals5的表达在miR160超表达系和对照中无显著差异,其与miR160在高温处理5天时花粉可育的表型相一致。另外,高温条件下miR160超表达系中JA合成相关基因DAD1、OPR3、LOX4的表达均比对照要低,其可能是高温条件下miR160超表达系花药不开裂的原因。因此本人推测miR160超表达抑制了生长素信号抑制型转录因子ARF10和ARF17的表达,从而激活了生长素信号,激活的生长素信号随后抑制了JA的合成,最终导致miR160超表达系的花药在高温胁迫下不能开裂引起雄性败育。5、正常温度下,miR157超表达棉花植株表现出植物器官变小,花期提前的表型。本研究对棉花miR157超表达株系进行高温处理后发现,超量表达miR157同样增加了花药对高温的敏感性,表现为花药不开裂和花粉败育。对miR157及其靶标的qRT-PCR的检测结果显示,miR157受高温诱导上调表达,且在正常和高温条件下,超表达植株中miR157的表达量都显著高于对照。其靶标SPLs同样受高温诱导上调表达,但在超表达系中的表达量低于对照。进一步分析发现miR157超表达棉花花药中的生长素合成基因YUC5的表达受到抑制。因此,结合miR160超表达棉花株系及生长素喷施均增加棉花花药对高温的敏感性的结果,本研究认为生长素信号对高温胁迫下花药育性极为重要,而多种mi RNA参与了生长素信号调控花药育性的过程。