血细胞（Hemocytes）在无脊椎动物中行使免疫细胞的功能,同脊椎动物的血细胞类似,在先天免疫中起到举足轻重的作用。传统观念认为,成熟的循环血细胞缺乏增殖能力,然而在无脊椎动物中进行的单细胞RNA测序结果以及后续的功能研究对这一观点提出了挑战。COP9信号体（Constitutively photomorphogenic 9 signalosome,CSN）是存在于整个动物界中的保守蛋白复合物,其中COP9信号体亚单元5（COP9 signaling subunit 5,CSN5）较为独特,通常以稳定的单体存在,涉及许多信号传导途径,主要参与细胞周期调节,并能通过调节细胞周期参与调控免疫细胞稳态和免疫应答。然而CSN5在不同物种和细胞之间对于细胞增殖的调控模式具有争议性,其作用机制在无脊椎动物中也尚不明确。鉴于在无脊椎动物中,血细胞增殖和分化动态过程的分子机制在很大程度上是未知的,本论文以中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）这一无脊椎动物代表物种作为研究对象,深入探究了中华绒螯蟹CSN5（EsCSN5）通过调控细胞周期影响血细胞增殖,进而介导宿主抗菌免疫的分子机制。本研究首先使用金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）分别感染了中华绒螯蟹血细胞,同时检测了血细胞的增殖水平,之后通过流式细胞术分选收集得到未增殖的和增殖的血细胞,并对两类细胞亚群的基因表达特性进行了分析。实验结果表明革兰氏阳性菌和阴性菌均能够诱导血细胞增殖,而在增殖细胞中,中华绒螯蟹细胞周期蛋白E（EsCyclin E）显著高表达,Csn5则处于较低的表达水平。鉴于CSN5和Cyclin E在细菌感染引起的中华绒螯蟹血细胞增殖进程中行使着潜在功能,本研究克隆得到了完整的EsCsn5和EsCyclin E的c DNA序列,EsCsn5全长1080bp,开放阅读框包含359个氨基酸;EsCyclin E全长1260bp,开放阅读框包含419个氨基酸。生物信息学分析显示EsCSN5和EsCyclin E符合传统的进化规律,此外结构域所对应的氨基酸序列比对以及三维结构比对结果表明二者具有物种间的高度保守性。实时荧光定量PCR显示EsCsn5和EsCyclin E在中华绒螯蟹含有血细胞的不同组织中均有不同程度的表达。细菌攻毒后,EsCyclin E的表达被显著诱导,同时EsCsn5的表达被显著抑制,暗示上述基因参与了血细胞增殖介导的抗菌免疫的调控。进一步的研究发现,当EsCsn5被敲降时,中华绒螯蟹血细胞的增殖显著增强,表明CSN5在中华绒螯蟹血细胞增殖的负调节中起到关键作用。随后我们发现,EsCSN5在中华绒螯蟹中以复合体和单体两种形式存在,而敲降EsCsn5对复合体的蛋白质表达量的影响十分有限。为了进一步完善EsCSN5调控中华绒螯蟹血细胞增殖介导抗菌免疫的调控模式,将血细胞的细胞周期同质化到G0/G1期,并通过不同时间点EsCyclin E的蛋白表达量将中华绒螯蟹血细胞周期划分为G1早期、G1晚期和S到G2/M期,收集这三个时期的细胞分别沉默EsCsn5,EsCsn8和EsCyclin E检测该调控机制的生效时期。实验结果表明只有在敲降EsCsn5时能够明显加速G1期早期的进程,且仅对此时期有显著影响,暗示该调控路径是EsCyclin E依赖性的,且EsCyclin E是潜在的下游靶点。在此基础上对具体的分子机制进行了探究,在工具细胞HEK293T细胞中同时过表达EsCSN5和EsCyclin E发现EsCyclin E被显著降解,体外泛素化检测证实这种降解是通过泛素化修饰实现的,并且EsCsn5在EsCyclin E的转录调控中没有作用。而共表达EsCSN8和EsCyclin E对EsCyclin E蛋白没有显著影响。此外,EsCyclin E受抑制的中华绒螯蟹存活率显著降低,血淋巴细菌浓度显著上调。因此,EsCSN5单体可以通过在G1期早期泛素化降解EsCyclin E作为血细胞增殖的共同调节因子,以维持活跃的血细胞增殖以及中华绒螯蟹的免疫稳态。综上所述,本研究提供的证据表明,中华绒螯蟹血细胞在细菌感染后抑制EsCSN5单体的表达,导致Cyclin E蛋白在G1期早期大量富集,细胞周期进程加快进而促进细胞增殖,以增强细菌清除能力保护宿主免受感染。本研究首次深入解析了无脊椎动物免疫细胞即成熟循环血细胞增殖的分子机制,并明确了CSN5在甲壳动物中发挥功能的作用方式,为甲壳动物固有免疫机制研究的完善提供了重要的参考意义。