论文部分内容阅读
丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科鼠尾草属多年生药用草本植物,因其基因组小和转化体系高而被称为模式药用植物。丹参药用部位为根和根茎,有效成分主要是可用于治疗冠心病、心肌梗塞等心脑血管疾病的丹参酮和丹酚酸类次生代谢产物,因此丹参具有着极高的药用价值。近年来关于丹参的研究热点已逐步集中于在使用基因工程等技术手段来提升丹参中代表性次生代谢产物的含量。DELLA转录因子是参与植物赤霉素（GA）调控途径的转录因子,其通过蛋白-蛋白相互作用调控植物体内多种激素信号通路,同时DELLA也参与了调控植物次生代谢产物的合成。本课题选择在实验室已有的SmDELLA研究基础上对其开展深入研究,结合已有SmDELLA干涉株系,再进一步获得了SmDELLA基因过表达株系,对SmDELLA转基因株系中丹参次生代谢产物含量、次生代谢产物合成途径关键酶基因的表达量的变化进行了系统研究,再结合体外实验对SmDELLA互作蛋白因子进行了验证,并完整阐述了 SmDELLA在丹参中对于次生代谢产物的调控以及其分子作用机理。本研究主要内容及研究结果如下:1.构建4条SmDELLA基因的过表达载体,并通过农杆菌介导的叶盘转化法获得4条SmDELLA基因的过表达株系,通过DNA和RNA水平验证后确定了SmDELLAs的转基因阳性株系,并对基因表达水平进行了考察,最终选择过表达效率较高的 OE-DEL1-1、OE-DEL1-2、OE-DEL1-5、OE-DEL2-1、OE-DEL2-2、OE-DEL2-3、OE-DEL3-1、OE-DEL3-2、OE-DEL4-1 和 OE-DEL4-3 株系用于后续实验过程,为研究丹参SmDELLA的具体功能提供了实验基础。2.分别对4个SmDELLA过表达株系中总酚酸总黄酮的含量进行了考察,和对照组相比,OE-DEL1-1、OE-DEL1-5和OE-DEL2-2总酚酸的含量分别提高了 2倍、1.75倍和2.5倍,同时过表达株系中总黄酮含量也显著增加,OE-DEL1-1及OE-DEL2-2分别是对照组的2倍和2.3倍左右。进一步对SmDELLA过表达和干涉转基因株系中丹酚酸类产物的含量进行测定,结果显示丹参SmDELLA过表达株系中迷迭香酸和丹酚酸B含量均显著增加,尤以SmDELLA1、SmDELLA2的过表达株系最为显著:OE-DEL1-1、OE-DEL1-2、OE-DEL2-1 和 OE-DEL2-3 株系中迷迭香酸分别比对照含量增加了 2.1倍、2倍、1.7倍和2倍;OE-DEL1-2、OE-DEL2-2和OE-DEL4-3株系中丹酚酸B含量为对照株系含量的1.7倍、2倍、2倍。而在干涉株系中,ir-D2-R8、ir-D2-R12、ir-D3-R4、ir-D4-R4 和 ir-D4-R5 株系中丹酚酸 B的含量为对照的50%,而作为丹酚酸B前体物质的迷迭香酸则变化不显著。以上结果显示SmDELLA可能对总酚酸、总黄酮以及丹酚酸B类物质起到了正调控作用。3.选择丹参SmDELLA转基因株系为实验材料,对丹酚酸合成通路上的关键酶基因进行表达量进行检测。结果显示,在丹参SmDELLA过表达株系中,酚酸类合成通路上的酶基因SmPAL1、Sm4CL1、SmC4H1、SmRAS1和SmTAT1均显著上调,而在干涉株系中结果正好相反,说明了SmDELLA基因可能通过调控代谢合成通路上的重要酶基因的表达来调控次生代谢产物的合成积累,且对丹酚酸合成起正调控作用。4.选择丹参SmDELLA转基因株系为材料,分别对赤霉素的含量以及赤霉素合成通路上的重要酶基因表达量进行了系统考察。丹参过表达株系中赤霉素含量变化不显著,而干涉株系中赤霉素含量则呈现升高的趋势。对赤霉素合成通路上关键酶基因表达量结果显示,负调控基因SmGA2ox5和SmGA2ox11在过表达株系中表达量显著升高,在干涉株系中则是普遍降低,而发挥正调控作用的SmKO、SmKAO1和SmKAO2在SmDELLA过表达株系中呈现降低趋势,但是在干涉株系中则是高表达。结果显示着SmDELLA对于赤霉素合成起到了负调控作用。5.本实验利用酵母双杂实验和双分子荧光互补实验完成了对SmDELLA互作蛋白的考察,结果显示4个SmDELLA蛋白均可以和SmJAZs、SmMYB97、SmMYC2等丹参调控次生代谢的转录因子相互作用,也表明了 SmDELLA蛋白可以通过和其他调控途径上的转录因子相互作用的方式调控下游靶基因,进而影响丹参中次生代谢产物的积累。6.为进一步探究丹参DELLA蛋白的功能,本研究利用荧光素酶报告基因实验分析了 SmDELLA1对SmMYB97直接激活关键酶基因SmPAL1和SmTAT1启动子过程的影响。结果显示SmDELLA1使靶基因SmPAL1受SmMYB97激活的水平降低,而对于靶基因SmTAT1则是进一步促进了 SmMYB97的激活效果。荧光素酶报告基因实验也表明了 SmDELLA可直接调控靶基因的转录因子SmMYB97从而影响丹参酚酸类物质的积累。