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目的:研究necrostatin-1(Nec-1)对PD细胞模型线粒体失能损伤及其诱导的细胞死亡过程中自噬和凋亡途径的影响。
方法:采用6-OHDA处理PC-12细胞建立PD细胞模型。MTT法检测细胞存活率。荧光探针技术观察细胞凋亡及溶酶体数量的变化及其可能的相互关系。用JC-1试剂盒检测线粒体膜电位的变化。用细胞免疫化学染色方法观察Nec-1对TH阳性细胞的影响。利用透射电镜和MDC染色法观察PC-12细胞中自噬的激活,Western Blot法检测自噬相关指标LC3-Ⅱ、cathepsinB与抗凋亡指标Bcl-2蛋白表达的变化。
结果:
1、MTT结果6-OHDA作用PC-12细胞存在时间剂量依赖关系,Nec-1在一定的浓度范围内(5-60μmol/L)存在保护作用,浓度超过90μmol/L有加重损伤作用。
2、荧光探针结果溶酶体荧光在6-OHDA作用2h即可观察到,6-9h达高峰,24h荧光减少,细胞核凋亡荧光4h可测到,并随时间延长而增多。
3、Nec-1有阻抑线粒体膜电位下降的作用。
4、细胞免疫化学染色结果与模型组相比,Nec-1组TH阳性细胞明显多于模型组。
5、电镜结果6-OHDA可使PC-12细胞内自噬体增多,并出现了凋亡特征。6-OHDA和Nec-1共作用24h自噬体与凋亡小体均减少。
6、MDC法观察PC-12细胞中自噬囊泡变化100μmol/L6-OHDA给药2h后即有大量自噬囊泡出现,并持续至给药后6h至12h,达到高峰后,24h自噬囊泡减少。
7、免疫印迹实验结果6-OHDA作用2h,4h,6h,12h,24h LC3-Ⅱ表达逐渐升高。与正常对照组相比,6-OHDA和自噬激活剂rapamycin明显提高LC3-Ⅱ的表达,Nec-1能明显抑制6-OHDA却不能抑制rapamycin诱导的LC3-Ⅱ的表达。与正常对照组相比,模型组cathepsinB表达明显增加而Bcl-2的表达显著降低。与模型组相比,Nec-1组与广谱蛋白酶抑制剂UTI组降低cathepsinB表达并使Bcl-2的表达增加。
结论:本实验成功地建立了6-OHDA诱导的PC-12细胞损伤的PD细胞模型,6-OHDA能够诱导PC-12细胞凋亡,并在一定浓度范围内(25-250μmol/L)存在时间和剂量依赖性。自噬/溶酶体途径参与PC-12细胞的死亡过程:线粒体失能诱导自噬过度活跃,cathepsinB表达增加,同时Bcl-2表达降低,促进线粒体膜电位下降,形成恶性循环,最终导致细胞死亡。Nec-1在一定的浓度范围内(5-60μmol/L)可提高细胞存活力,通过稳定线粒体膜电位,抑制过度自噬降低LC3-Ⅱ、cathepsinB的表达,上调Bcl-2的表达,发挥神经细胞保护作用。