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目的:探讨表达趋化因子CCL17的树突状细胞对Treg细胞增殖的影响以及可能存在的分子机制,进一步研究表达CCL17的树突状细胞作用后的Treg细胞对CD8~+T细胞的功能影响,为表达趋化因子CCL17的树突状细胞在肿瘤免疫治疗中的应用提供新的思路和方法。方法:一、以BABL/C雄性小鼠为模型⑴分离4-8周龄的小鼠脾淋巴细胞并在体外诱导刺激为Treg细胞,分离骨髓细胞并在体外诱导分化为BMDC细胞;通过流式细胞仪检测Treg细胞及BMDC细胞表面标记分子表达情况;荧光定量PCR检测BMDC中CCL17的表达,同时观测BMDC细胞的形态学特征。⑵利用脂质体转染法,将siRNA CCL17通过脂质体Lipofection 2000转染至BMDC细胞,通过FAM对照组检测转染效率,荧光定量PCR检测转染后的CCL17表达情况。⑶利用CFSE染色法染色Treg细胞,将Treg细胞分为三组,分别与外源重组蛋白CCL17、表达CCL17的BMDC细胞以及转染了siRNA CCL17的BMDC细胞共培养,通过流式细胞仪及细胞计数的方法检测Treg细胞的增殖情况。⑷利用western bolt法检测CCL17~+BMDC与Treg细胞共培养后,参与调控Treg细胞增殖的通路蛋白STAT5的表达情况。⑸体外构建一个简单的肿瘤微环境,一共选取了四个细胞,分别为CD8+T细胞、黑色素瘤细胞、CCL17~+BMDC细胞、Treg细胞。分别将重组蛋白CCL17、siRNA CCL17的BMDC、CCL17~+BMDC与Treg细胞共培养,再与CD8~+T细胞及黑色素瘤细胞共培养,酶标仪检测CD8~+T细胞对黑色素瘤细胞杀伤活力的影响。二、以人源树突状细胞为模型⑴利用pcDNA3.1(-)载体通过基因工程的手段,成功将人Foxp3基因片段构建到载体上,通过测序成功获得无突变的重组质粒pcDNA3.1-Foxp3。⑵已知Jurkat细胞是外周血CD4~+T淋巴细胞瘤,利用电转的方法将构建好的重组质粒pcDNA3.1-Foxp3电转至Jurkat细胞,使其表达具有Treg样细胞的相关表达,利用荧光定量PCR检测转染后细胞表面相关分子的表达。⑶分离健康人PBMC,获取单核细胞并在体外刺激诱导出成熟的DC细胞,PCR检测CCL17的表达。⑷将外源重组CCL17、加入了中和抗体CCL17的DC及CCL17~+DC分别与Jurkat-Treg样细胞共培养,流式细胞仪及荧光计数检测Treg样细胞的增殖情况。结果:在小鼠模型中,体外诱导的成熟BMDC细胞可高表达趋化因子CCL17,利用脂质体lipofection2000转染siRNA CCL17至BMDC细胞中,结果发现转染组CCL17的mRNA表达明显低于非转染组,说明转染成功。将重组蛋白CCL17、CCL17~+BMDC、siRNA CCL17 BMDC分别与Treg-CFSE细胞共培养,流式细胞仪检测CFSE~+CD25~+双阳性细胞的表达,结果发现CCL17~+BMDC共培养组中,CFSE~+CD25~+细胞的表达显著低于siRNA CCL17转染组;同时荧光下计数,观察Treg细胞的生长数量变化,观察结果随着共培养的时间延长,CCL17~+BMDC存在时,Treg细胞的增殖速度明显低于siRNA CCL17转染组。接着探究CCL17~+BMDC细胞影响Treg细胞增殖的分子机制,通过Western Blot方法检测蛋白p-STAT5的表达情况,结果发现与siRNA CCL17转染组相比,CCL17~+BMDC细胞作用的Treg细胞中p-STAT5的表达降低,接着模拟了一个体外的肿瘤微环境,我们分了五个组:CD8~+T细胞、B16F10;Treg、CD8~+T细胞、B16F10;rmCCL17、Treg、CD8~+T细胞、B16F10;CCL17~+BMDC、Treg、CD8~+T细胞、B16F10;siRNA CCL17 BMDC、Treg、CD8~+T细胞、B16F10,利用钙黄绿素法检测发现,与siRNA CCL17 BMDC+Treg共培养相比,重组蛋白CCL17、CCL17~+BMDC组别中CD8~+T细胞的杀伤活增高。接下来以人源树突状细胞为模型,利用基因工程的方法成功构建重组质粒pcDNA3.1-Foxp3,电转至Jurkat细胞构建Jurkat-Treg样细胞,利用荧光定量PCR检测电转后的Jurkat细胞表面分子(与Treg细胞相同的表面分子)Foxp3、GZMB、CTLA-4、PRF1,结果发现表达均升高。将构建好的Jurkat-Treg样细胞分别与外源重组蛋白CCL17、加入了中和抗体CCL17的DC细胞、CCL17~+DC细胞共培养,流式细胞仪检测Jurkat-Treg样细胞的表面分子CD4CD25的表达,结果发现与中和抗体CCL17的DC组相比,CCL17~+DC组中表达CD4CD25双阳性的细胞显著降低,同时荧光下计数,发现随着共培养的时间延长,与加入了中和抗体CCL17的DC相比,CCL17~+DC组中Jurkat-Treg样细胞增殖受到抑制。结论:在小鼠模型中,表达趋化因子CCL17的BMDC细胞能够抑制Treg细胞的增殖,并且研究可能是通过STAT5信号通路影响Treg细胞的增殖,同时CCL17~+BMDC作用的Treg细胞对CD8~+T细胞的功能也会产生一定的影响。此外在人源细胞模型中,CCL17~+DC细胞同样具有抑制Jurkat-Treg样细胞增殖的作用。综上所述,表达趋化因子CCL17的树突状细胞具有干扰Treg细胞的增殖的作用。