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近年来我国临床上鸭乙型肝炎(Duck hepatitis B virus,DHBV)的危害日益加重。由于鸭乙型肝炎病毒呈垂直传播,其在种鸭中的持续性感染可能对种蛋孵化和雏鸭造成较大的危害。本研究建立了检测DHBV的核酸探针杂交检测方法,并选取不同区域病死种鸭、肉鸭、死胚和弱雏进行流行病学调查,在此基础上随机选择部分DHBV野毒株进行全基因组测序及序列分析,以期为养鸭业生产中DHBV的科学防控提供参考依据。本研究共分为四部分:1.DHBV在山东、江苏两地发病鸭群的PCR检测从山东、江苏两个省份10个鸭群采集的临床有发病症状的150只病死鸭的心、肝、脾、肺、肾五种脏器。以提取的组织DNA为模板用普通PCR方法检测DHBV的感染情况并统计每个鸭群及各个内脏器官的检出率。结果表明DHBV的群体阳性率为100%,个体阳性率为41.3%。被检测的器官中,肝脏的阳性检出率达100%,其他器官阳性检出率从高到低依次是心脏、脾脏、肺脏和肾脏,分别为77.4%、71.0%、67.7%和66.1%。2.DHBV核酸探针的制备与应用将PCR扩增后测序正确的DHBV C区的一段长423bp的高度保守序列克隆制备成地高辛(DIG)标记核酸探针。特异性试验结果表明,制备的核酸探针只与DHBV的DNA杂交呈阳性,与其他常见病原微生物的DNA杂交呈阴性。敏感性试验结果表明,该探针对DHBV的最低检出量约为3pg DHBV的DNA。应用该探针对从山东、江苏和安徽三个省份16个鸭群采集的150个死胚,150只弱雏以及临床有发病症状的350只病死肉鸭和360只病死种鸭进行检测,结果个体阳性率分别为52%、50.7%、46.9%和45.3%。同时对弱雏的12种内脏器官以及成年鸭的5种器官组织DNA进行检测,结果在被检测的器官中,肝脏的DHBV阳性检出率最高,达100%。将检测结果与上述样品的PCR检测结果进行比较,发现两种检测方法的阳性个体检出符合率为100%,而核酸探针检测的各种器官检出率略低于PCR检测。结果表明,制备的DIG标记的核酸探针特异性强,灵敏度较高,适合对DHBV进行大批量的诊断和流行病学调查。3.DHBV野毒全基因组测序及基因进化分析用普通PCR方法对发病最为严重的6个鸭群随机选取的6株DHBV野毒进行全基因组扩增并测序,随后与其他15株GenBank已发表的全基因组序列进行同源性分析和进化树构建。序列分析结果表明,6株野毒全基因组序列之间的同源性在89.8~99.8%,与其他15株已发表的序列同源性在89.5~99.8%。进化树分析发现6株野毒与中国分离株同属一个分支。6株野毒之间的C蛋白氨基酸同源性在96.6~100%,与其他15株参考毒株同源性在96.2~100%;S蛋白氨基酸同源性在89.7~99.7%,与其他15株同源性在84.8~100%;P蛋白氨基酸同源性在85.3~99.6%,与其他15株同源性在84.8~99.5%。结合进化树分析可以发现,C蛋白与其他毒株最相似,高度保守,S蛋白与P蛋白则异质性较高。4.动物试验对100只3日龄的雏鸭肌肉注射6.6×10~5拷贝/μL的DHBV基因组的阳性血清200μL,置于SPF隔离罩中饲养,每次随机抽取6只采血,采样时间为攻毒后第2天、第3天、第4天、第5天、第7天、第9天、第12天,此后每隔一周采血一次,用SYBR GreenⅠ荧光定量方法检测血液中DHBV病毒载量。检测结果显示在血液中第5天检测出病毒,第12天病毒载量达到峰值,随后逐渐下降,但试验期内无自然转阴现象。剖检可见花斑脾,肝脏出血。