腹膜粘连是很常见的并发症，尤其是剖腹术后。其结果是原本分离的脏器之间或脏器与腹壁之间出现范围不定的粘连或形成纤维索带。腹部术后粘连形成引起严重并发症，导致疼痛、肠梗阻、以及女性不孕等病症。虽然近年有事实证明部分遭受粘连妇女受益于粘连松解术，但粘连复发仍然是手术后最大问题。据报导术后粘连患者在粘连缓解后，复发率高达55％～95％。预防术后粘连的大量辅助疗法被评价，但运用中草药防治粘连的报导较少。因此，发挥中医药治疗肠粘连的优势和特色，积极探求中医药治疗肠粘连的有效方法，防止或延缓其发展具有重要的意义。南方医院研制的CTOL，为治疗肠粘连的中药制剂，含大黄、丹参等中药材。CTOL作为医院制剂，在临床防治肠粘连患者多年，疗效确切。临床观察和动物实验研究均表明，本品可显著抑制术后早期腹膜局部纤溶活性（LFA）的降低，降低腹膜血管通透性，减少渗出，促进肠蠕动等药理作用，该药在一定程度上可改善肠粘连一般症状，保护脏器，延缓肠粘连的进展。但其治疗肠粘连的细胞分子水平的作用机制尚不清楚，有待进一步研究。因此，本课题通过动物和细胞实验，从细胞分子水平，探讨CTOL治疗肠粘连的细胞分子基因水平的作用机制，为其临床应用提供实验依据。第1章CTOL对肠粘连大鼠模型的实验研究目的：通过建立大鼠肠粘连模型，观察CTOL对术后肠粘连的作用，并对术后粘连大鼠血液中白细胞（WBC）计数、纤维蛋白原（FIB）浓度、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子β₁（TGF-β₁）、白细胞介素-1β、4、6、10（IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10）水平进行检测与分析。探讨WBC、FIB及细胞因子对术后粘连形成的影响，为进一步研究药物作用机制提供实验依据。方法：选用SD雄性大鼠54只，随机分为6组，除正常对照组外，其余大鼠均按Ellis法制备成肠粘连模型。正常对照组及模型对照组均给予等体积蒸馏水灌胃，阳性对照药选用功效与主治基本相似的四磨汤口服液。受试药物剂量（以生药量计）为4.3g／kg、8.6 g／kg、17.2 g／kg，分别是临床剂量的5倍、10倍、20倍。阳性对照药剂量相当于CTOL中剂量倍数。（1）术后第7d进行粘连程度肉眼分级，判断标准参考Nair的5级分类法；（2）取标本进行病理切片观察；（3）腹主动脉取血，采用电阻法测定大鼠五分类血常规，凝固法测定FIB，酶联免疫吸附法（ELISA）测定TNF-α、IL-1β、TGF-β₁、IL-4、IL-6、IL-10水平；结果：（1）粘连程度比较：腹部手术后第7d，各组动物均存活。模型对照组均发生粘连，粘连带厚实难以剥离。相反，其余经药物处理的4组粘连带窄、薄膜状，甚至无粘连出现，粘连程度显著低于模型对照组（P＜0.01）；（2）血浆中FIB浓度及WBC计数的比较：与正常对照组比较，模型对照组大鼠血中FIB、WBC显著增加（P＜0.001）。与模型对照组比较，四磨汤、CTOL低、中、高剂量组均能显著降低大鼠血中FIB、WBC的含量（P＜0.05）。（3）比较血清细胞因子水平：模型组致炎细胞因子TNF-α、TGF-β₁、IL-1β、IL-6水平与正常对照组比较有显著性差异（P＜0.01），但抗炎细胞因子IL-4和IL-10没有统计学意义（P＞0.05）。正常对照组与各实验组间细胞因子水平均无显著性差异。与模型对照组比较，CTOL低、中、高剂量均能显著降低大鼠血中TNF-α、IL-6浓度（P＜0.05，P＜0.01）；CTOL中、高剂量TGF-β₁、IL-1β水平显著低于模型对照组（P＜0.05，P＜0.01），但低剂量无显著性减少。此外，CTOL低、中、高剂量血中IL-4、IL-10水平呈上升趋势，但无统计学差异。四磨汤的功效与CTOL作用相似。结论：CTOL对大鼠肠粘连模型有显著预防作用。本品能减轻模型大鼠的肠粘连程度，改善粘连部位的病理损伤，降低血浆中WBC计数及FIB浓度，降低血清致炎细胞因子：TNF-α、IL一1β、TGF-β₁、IL-6水平，但对抗炎细胞因子：IL-4、IL-10水平无影响。本实验进一步证明CTOL具有防治肠粘连的作用。第2章CTOL对体外培养的正常及粘连腹膜成纤维细胞增殖的影响目的：探讨CTOL对体外培养的正常腹膜成纤维细胞（NF）及粘连腹膜成纤维细胞（AF）增殖及细胞周期的影响，为进一步分子作用机制的研究提供实验依据。方法：（1）药物血清的制备：雄性SD大鼠20只，随机分为4组：正常血清组，CTOL低、中、高剂量组。大鼠灌服相应剂量的药物7d后，腹主动脉采血，分离药物血清。（2）成纤维细胞的体外培养：取SD肠粘连模型大鼠粘连腹膜组织，正常腹膜组织取自同一大鼠前腹壁。采用组织块贴壁培养法进行成纤维细胞培养，待细胞从组织块中长出并融合成致密单层后，用0.25％胰蛋白酶消化，以1∶3传代。本实验所用细胞为第3～8代。（3）成纤维细胞的纯化及鉴定：因成纤维细胞对胰酶消化敏感，故反复传代和换液后即可得到纯化的成纤维细胞。免疫组化鉴定一抗为鼠抗波形蛋白抗体，空白对照以PBS代替一抗。（4）成纤维细胞的增殖：①MTT比色法：细胞以5×10²／孔接种到96孔培养板，分别加入CTOL低、中、高剂量的含药血清和空白对照血清，培养24h，48h、72h、96h。MTT法观察细胞增殖情况。②BrdU免疫荧光法：取生长状态良好的AF，胰酶消化后，按5×10⁵／孔接种于放有盖玻片的24孔培养板中，12h后将培养基中的胎牛血清浓度降至1％，8h后在上述细胞中分别加入：5％含药血清；5％正常血清；PAI-1，浓度为1ng／ml；tPA，浓度为1ng／ml。同时设置10％胎牛血清做空白对照孔。培养24h后，加BrdU掺入，37℃、5％CO₂孵箱中继续孵育4h，细胞用4％多聚甲醛固定，免疫荧光检测细胞增殖情况。（5）透射电镜标本的制备：取生长状态良好的NF及AF，每瓶计数约2.5×10⁶个，分别加入正常血清和含药血清，每种细胞设1O％胎牛血清组为对照组，培养24、48h后，胰酶消化，离心，将细胞用2.5％戊二醛固定30min，透射电镜观察细胞形态及结构。（6）细胞周期：分别取对数生长期的NF及AF，每瓶计数约2.5×10⁶个，分别加入正常对照血清，CTOL中、高剂量含药血清，培养12、24、48h后，胰酶消化，离心；再加入预冷的无水乙醇固定，4℃冷藏过夜。加入PI染液孵育30min，流式细胞仪检测分析成纤维细胞周期。结果：（1）生长速度的比较：NF及AF在体外培养情况下均较易生长，AF比NF生长速度更快。（2）成纤维细胞的纯化及鉴定：波形蛋白免疫细胞化学染色显示成纤维细胞胞质染成棕色或深棕色，为阳性产物，细胞核为淡蓝色。而空白对照的细胞胞质未见棕色反应产物。（3）成纤维细胞增殖：药物剂量与吸光度OD值之间存在负相关性，同时药物剂量与抑制率之间存在正相关性。与NF正常血清对照组比较，CTOL各剂量组在作用24h、48h时，其OD值均无显著性变化（P＞0.05）；但当作用72h、96h时，其OD值均呈显著性降低（P＜0.01）；与AF正常血清对照组比较，CTOL低、中、高剂量组药物血清作用AF 24h、48h、72h、96h，其OD值均呈显著性降低（P＜0.05）；同一时间点比较，CTOL低剂量对AF的抑制率比对NF的抑制率高，但无统计学差异。CTOL中剂量在作用96h，对AF的抑制率与NF的抑制率比较，有统计学差异（P＜0.05）。CTOL高剂量在作用72h、96h，对AF的抑制率与NF的抑制率比较，均有统计学差异（P＜0.05）。（4）BrdU免疫荧光法：与胎牛血清组比较，CTOL、PAI-1、tPA的阳性率均有统计学意义（P＜0.05）；而正常血清组无统计学意义。（5）成纤维细胞超微结构：NF和AF在透射电镜下观察到的超微结构基本相同，核为椭圆形，核仁明显。药物血清对AF超微结构有影响，但对NF的超微结构影响不大，正常血清对NF及AF的超微结构影响均不明显。（6）细胞周期：与正常血清组比较，CTOL中剂量作用12h、24h、48h对NF的DNA合成前期（G1期）细胞比例无显著影响，而高剂量含药血清组的NF的G1期细胞比例显著增加，且具有统计学意义（P＜0.001）。与正常血清组比较，CTOL中、高剂量含药血清组的AF在12h、24h、48h的G1期细胞比例均显著升高，且具有统计学意义（P＜0.01）。而S期及G2期细胞比例呈下降趋势，但各组间无显著性差异。因此，CTOL中、高剂量药物血清对AF的增殖均有抑制；但对NF而言，仅高剂量药物血清能抑制其增殖。结论：CTOL可以抑制体外培养的NF和AF增殖，调整细胞周期。CTOL对成纤维细胞增殖的抑制率之间存在剂量依赖关系，而且，药物血清对AF作用更敏感。第3章实时荧光定量PCR评价成纤维细胞目的基因mRNA的表达目的：通过实时荧光定量PCR方法检测NF及AF运用CTOL药物血清处理后，相应目的基因在mRNA的表达水平的变化。方法：（1）成纤维细胞的收集：取生长状态良好的NF及AF，每瓶计数约2.5×10⁶个，分别加入5％CTOL低、中剂量含药血清，以10％胎牛血清为对照组，培养48h后，提取总RNA。（2）总RNA提取：按照TANGEN RNAprep培养细胞总RNA提取试剂盒说明书操作。（3）TaqMan探针及引物：采用Primer 2.0软件设计目的基因IL-1β，IL-6，IL-10，TGF-β₁，TGF-β₂，TIMP-1，MMP-1，TPA，PAI-1，INF-γ和内参照β-actin PCR引物及TaqMan探针。（4）逆转录（Reverse Transcription，RT）反应：取灭过菌且无核酸酶的0.2mlPCR管，在冰上依次加入2μg总RNA、10μM Olige dT_（18）、10mM dNTTs及无核酸酶的双蒸水至总体积15.5μl，65℃保温5min，然后冰浴5min；在0.2mlPCR管再依次加入下列组份：RNase抑制剂（40U／μl），10×AMV Reaction Buffer，DTT（IM），及逆转录酶（AMV）。先在37℃保温1h，然后70℃保温15min；RT反应混合液放置4℃立即进行PCR扩增，或-20℃保存备用。（5）PCR反应：以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增反应。反应体系（20μl）：10×Buffer、2.5mM dNTPs、25μMPrimer1、25μM Primer2、cDNA（RT反应产物）模板、5U／μ1 Taq pfu聚合酶。PCR扩增条件：94℃变性，30s；56℃退火，30s：72℃延伸，30s；31个循环；72℃，5min；4℃stop。（6）标准曲线的建立：为了测定目的基因转录的绝对拷贝数，将IL-1β、IL-6、IL-10、TGF-β₁、TGF-β₂、TIMP-1、MMP-1、tPA、PAI-1、INF-γ及β-actin PCR扩增产物绘制标准曲线。PCR产物经TIANquick Midi试剂盒纯化回收。PCR扩增片断大小分别为β-actin 106bp；IL-1β141bp IL-6 94bp；IL-10 155bp；INF-γ141bp；PAI 195 bp；TGF-β₁ 130bp；TGF-β₂ 183bp；TIMP-1 129bp；MMP-1 81bp。DNA模板拷贝数通过目的基因分子质量，阿佛加得勒常数(1摩尔=6.022×10²³分子)转换得到。PCR纯化产物经10倍梯度稀释成10⁵～10¹⁰拷贝数／μl。每个反应体系的荧光强度及循环域值（C_T）可以测得。（7）TaqMan实时荧光定量PCR反应：PCR反应在96孔中进行。每个反应体系含1μlRT产物或DNA梯度稀释模板，5×PCR Buffer，25 mM dNTPs，25μM上游引物及下游引物，10pmol／ul TaqMan探针，5U／ul Hotstart Taq DNA聚合酶及灭菌蒸馏水至总体积25ul。待测标本，标准品及阴性对照均放置在MJ Research^R DNAEngine OPTICON 2进行反应。扩增条件：93℃3min；93℃45秒；55℃60秒；循环40次。将不同浓度的标准模板拷贝的对数和相应的C_T值作图，得到标准曲线。根据标准曲线，可以自动测出所有未知标本拷贝数。（8）目的基因mRNA表达水平：根据阳性模板标准曲线，可以计算出每个样品的目的基因及内参β-actin mRNA的表达水平。如IL-1βmRNA的绝对拷贝数以β-actin校正，用以最小化RT转录效率，RNA完整性及样品之间的差异。本实验以样品拷贝数／β-actin拷贝数×10³计算目的基因mRNA相对表达水平。结果：（1）AF的IL-1β、IL-6mRNA相对表达量比NF分别高274％（P＜0.01）、91％（P＜0.001）；与相应胎牛血清组比较，CTOL低剂量对NF的IL-1β、IL-6mRNA相对表达量的影响均无显著性差异，但对AF的IL-1β、IL-6mRNA相对表达量的影响均有显著性差异（19％；P＜0.05）、（32％；P＜0.01）；CTOL中剂量能显著降低AF及NF的IL-1β（68％；P＜0.05）、（20％；P＜0.05）、IL-6（64％；P＜0.001）、（47％；P＜0.01）mRNA表达水平。提示：CTOL能减少NF及AF IL-1β及IL-6表达，但对AF的作用更强。CTOL对成纤维细胞的作用存在剂量依赖关系。（2）AF的TGF-β₁、TGF-β₂ mRNA相对表达量比NF分别高52％（P＜0.001）、30％（P＜0.001）；与相应胎牛血清组比较，CTOL低剂量对AF及NF的TGF-β₁ mRNA相对表达量的影响均无显著性差异，但对TGF-β₂mRNA相对表达量的影响均有显著性差异（15％；P＜0.01）、（17％；P＜0.05）。CTOL中剂量能显著降低AF及NF的TGF-β₁（44％；P＜0.001）、（26％；P＜0.05）、TGF-β₂（50％；P＜0.001）、（31％；P＜0.001）mRNA表达水平。提示：CTOL能减少NF及AF TGF-β₁、TGF-β₂表达，但对AF的作用更强。CTOL对成纤维细胞的作用存在剂量依赖关系。（3）AF的MMP-1 mRNA相对表达量比NF高78％（P＜0.001）。与相应胎牛血清组比较，CTOL低剂量对AF及NF的MMP-1 mRNA相对表达量的影响均有显著性差异（17％，P＜0.01；13％，P＜0.05）。CTOL中剂量能显著降低NF的MMP-1 mRNA表达水平（27％；P＜0.01）；但却显著增加AF的MMP-1 mRNA表达水平（17％；P＜0.001）。AF的TIMP-1 mRNA相对表达量比NF高18％（P＜0.05）。与相应胎牛血清组比较，CTOL低剂量对AF及NF的TIMP-1 mRNA相对表达量的影响均无显著性差异。CTOL中剂量能显著降低NF及AF的TIMP-1 mRNA表达水平，分别降低17％（P＜0.05）、41％（P＜0.001）。而AF的MMP-1／TIMP-1mRNA表达水平的基础比率比NF高53％，提示：CTOL中剂量能显著增加AF的MMP-1／TIMP-1比率，而对NF的MMP-1／TIMP-1比率影响呈下降趋势。（4）AF的tPA mRNA相对表达量比NF低52％（P＜0.001）：CTOL低剂量对AF及NF的tPA mRNA相对表达量的影响均无显著性差异；CTOL中剂量能显著升高AF及NF的tPA mRNA表达水平，分别升高95％（P＜0.001）、26％（P＜0.001）。反之，AF的PAI-1 mRNA相对表达量显著高于NF（131％；P＜0.001）。CTOL低剂量对NF的PAI-1 mRNA相对表达量的影响无显著性差异，但却显著降低AF的PAI-1mRNA表达水平（15％，P＜0.01）。CTOL中剂量能显著降低NF及AF的PAI-1mRNA表达水平，分别降低28％（P＜0.01）、60％（P＜0.001）。因此，AF的tPA／PAI-1mRNA表达水平的基础比率显著低于NF（79％），然而，CTOL中剂量能显著增加NF及AF的tPA／PAI-1比率，分别为43％、79％。提示CTOL中剂量对AF的tPA／PAI-1比率影响更大。（5）AF及NF的IL-10mRNA相对表达量无显著性差异。CTOL低剂量对AF及NF的IL-10mRNA相对表达量的影响均无显著性差异。CTOL中剂量对NF的IL-10 mRNA相对表达量的影响无显著性差异，但能显著增加AF的IL-10 mRNA相对表达量（43％，P＜0.001）。然而，大部分样品检测不到INF-γmRNA表达水平。结论：本研究发现：CTOL对NF及AF相关细胞因子mRNA的表达具有调控作用，并且对AF的调控作用更强。这种调控作用的阐明，有助于认识CTOL防治肠粘连的分子作用机理。