肿瘤坏死因子(TNF)首先于1975年由Lloyd Old等发现,因最初发现内毒素能诱导机体一种糖蛋白的表达并引起实体性肿瘤的出血坏死而得名。TNF分游离型和跨模型,都有生物学活性。跨模型INF(tmTNF,26kD)经TNF转化酶裂解后成为游离型TNF分子(sTNF,17kD)。TNF是机体炎症反应的有力诱导因子,能调节固有性免疫并且在介导机体通过Thl类免疫应答抵抗胞内细菌及某些病毒感染过程中发挥重要作用。然而,TNF表达调节失控也会导致多种病理作用,包括免疫介导的炎症性疾病(IMIDs)如D-氨基半乳糖(GaIN)/脂多糖(LPS)诱导的急性肝损伤、LPS诱导的内毒素休克以及类风湿性关节炎(RA)。因此,TNF成为这些疾病的重要治疗靶点。TNF受体(TNFR)分TNFRI(p55)、TNFRII(p75)两种。由于天然状况下TNF以同源三聚体的形式结合至体内游离的或跨模型受体TNFRⅠ、TNFRⅡ而引发胞内下游一系列信号转导途径的活化引起相应的细胞生物学或病理生理过程,因此,模拟TNF同源三聚体形式的复合分子将能更有利于TNFR与TNF结合而拮抗模型受体与TNF的结合。目前在临床上使用的TNF拮抗剂主要是二价分子,包括可溶性肿瘤坏死因子受体II(sTNFRII)与IgG的Fc段形成的融合蛋白(sTNFRII-Fc)和TNF单克隆抗体(如嵌合型Infliximab、人源化Adalimumab)两大类。因市场庞大,新型高效TNF拮抗剂的研发是研究的热点。脂联素是脂肪细胞分泌的细胞因子,促进骨骼肌细胞和肝细胞对葡萄糖摄取和脂肪酸的氧化,降低血甘油三酯,并提高机体对胰岛素的敏感性。借助脂联素球部(gAD)可自行形成紧密同源三聚体的特性,我们研制出了三聚化的sTNFRII,即可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部(sTNFRII-gAD)融合蛋白。该蛋白能以更接近于天然TNF三聚体的形式结合TNF并拮抗其生物活性。研究认为,由于LPS的暴露而使TNF过度表达能导致肝脏受损。这一观点已经在用特异性抗体或抗血清中和循环TNF而减轻LPS诱导的急性肝损伤作用的实验中得到验证。现已研究表明,促炎症细胞因子级联反应的活化(包括TNF)被认为是临床上严重肝损伤结果这一病理过程中起重要作用的环节。因此,通过拮抗体内过度表达的TNF可以对因一些细菌特别是革兰氏阴性菌感染而引起的内毒素血症(休克)起治疗作用。另一方面,尽管RA的详细发病机制不甚了解但目前以人为其为一种系统性、进展性的伴随免疫炎症的自身免疫功能紊乱,其病理特点表现为主要引起关节滑膜损伤并导致软骨破坏直至骨关节的破坏。传统的疾病缓解抗风湿药物(DMARDs)虽然能有效地改善RA患者的临床症状及提高活动能力,但并未能阻止患者关节进行性损害。有研究发现一方面在RA患者的炎症性滑膜特别在关节软骨-关节翳连接处TNF表达明显增高；并且将人TNF基因敲入小鼠基因组后引起TNF过度表达并导致小鼠产生慢性多关节炎症,发病率达100%。所以,拮抗TNF已成为临床治疗RA的新方向。本研究利用真核细胞表达系统制备该融合蛋白,并通过内毒素诱导的急性肝损伤小鼠模型和类风湿性关节炎大鼠模型、研究其拮抗TNF的疗效,为最终能在临床应用奠定基础。方法1. sTNFRII-gAD体外生物活性研究1.1两种TNF拮抗剂体外生物活性比较①取对数生长期的L929细胞,0.25%胰蛋白酶消化后用1640完全培养液调整细胞合适密度；②取96孔培养板,每孔加入100uL细胞悬液,置37℃,5%CO2温箱孵育20h；③稀释样品sTNFRII-gAD、sTNFRII-Fc(稀释液中含标准品TNF及放线菌素D),弃上清；④加入100μl稀释样品,培养18～20h；⑤每孔加入15μl MTT,37℃孵育4h；⑥去上清,加入DMSO,在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值。1.2体外受体-配体复合物测定实验①小鼠重组TNF抗体包被96孔板；②4%BSA封闭,4℃过夜；③TBST洗涤后加入稀释好的rmTNF-sTNFRII-gAD或rmTNF-sTNFRII-Fc反应液；④经洗涤,加入检测抗体,孵育1h；⑤洗板5次,加入酶标二抗,室温孵育1h；⑥拍干,随后加入TMB显色液,放置10-20min；⑦加入终止液,450nm读板。2. sTNFRII-gAD对GaIN/LPS诱导的急性肝损伤(ALI)的治疗作用研究2.1GaIN/LPS诱导的急性肝损伤模型的建立BALB/c小鼠隔夜禁食后经腹腔注射GaIN/LPS混合液,阴性对照组注射等量生理盐水,连续观察12h。2.2sTNFRII-gAD对GaIN/LPS诱导的急性肝损伤的疗效观察①sTNFRII-gAD对ALI生存率的影响：实验分为正常对照、PBS阴性对照、sTNFRII-Fc阳性对照sTNFRII-gA组。部分小鼠(N=6)经腹腔注射GaIN/LPS后立即治疗,阴性组注射无菌PBS；另一部分小鼠(N=6)于造模后1h进行治疗。小鼠经治疗后连续观察12h,记录各组的生存率。②血清酶学变化：半致死剂量GaIN/LPS造模,分别于治疗后2、5h测定各组血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶。③sTNFRII-gAD对ALI肝脏组织病理学的影响：半致死剂量GaIN/LPS造模,治疗后5h处死,立即剪取10mm3肝脏置已准备好的10%中性甲醛溶液固定过夜,用于苏木素-伊红染色。2.3sTNFRII-gAD对GaIN/LPS治疗作用的机制研究①血清TNF定量及活性测定：半致死剂量GaIN/LPS造模,治疗后2、5h测定血清TNF及其活性；②血清sTNFRII-gAD-TNF复合物测定：造模并经治疗后5h采血。利用双抗体夹心法测定sTNFRII-gAD治疗组血清sTNFRII-gAD-TNF复合物；③肝脏Caspase-3测定：治疗后5h实验动物处死后立即剪取适量肝脏组织,置于-80℃用于Western bloting检测Caspase-3;④TUNEL法凋亡检测：治疗后5h实验动物处死后立即剪取0.5g肝脏组织置于10%甲醛固定过夜,切片后部分用于TUNEL法观察各组肝脏凋亡情况。3. sTNFRII-gAD对胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎(CIA)治疗作用研究3.1牛Ⅱ型胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎模型构建①牛Ⅱ型胶原溶液加入等量佛氏完全佐剂(CFA)中,4℃搅拌过夜；②雌性Wistar大鼠尾根部皮内注射制备好的Ⅱ型牛胶原乳剂(200μg)；③第7天再次胶原免疫(100μg)。3.2sTNFRII-gAD对CIA的疗效观察①CIA发病率、严重程度：第二次胶原免疫后第3天将大鼠随机分为PBS对照、sTNFRII-Fc阳性对照、sTNFRII-gAD实验组。正常对照为未经胶原免疫的Wistar大鼠。自当天开始每2天治疗一次,共3次；治疗前记录各组的CIA发病率、足爪肿胀、以及关节炎临床评分,直至第16天；②血清Ⅱ胶原抗体测定：分别于治疗前(d10)、治疗后(d16)采血,肝素钠抗凝。一部分用于流式测定,其余抗凝血经离心后用于测定抗-CII;③CIA大鼠踝关节组织病理学改变：治疗后2天(d16)截取大鼠踝关节置于10%中性甲醛固定,0.5%EDTA溶液脱钙处理,经包埋、切片后进行苏木素-伊红染色。3.3sTNFRII-gAD治疗CIA的机制研究①外周血TNF、IL-17A测定：分别于第10、16天测定血清TNF、IL-17A水平,观察治疗前后血清TNF、IL-17A变化情况；②外周血调节性T细胞测定：第10、16天采血抗凝后经CD4-FITC、CD25-PE表面标记及FOXP3-APC胞内标记后流式检测治疗前后外周血调节性T细胞。4.统计学分析所有计量资料用x±s表示,采用Oneway-ANOVA(Bonferroni)比较计量资料组间差异,方差不齐时用Welch法法校正,采用Dunnett T3进行两两比较；采用重复测量方差分析(Repeated ANOVA)比较各组不同时间点同一指标的变化,球形检验不满足时采用Greenhouse-Geisser法校正。检验水准a=0.05,双侧检验；Kaplan-Meier法比较各组生存率；实验中非参数资料采用多个独立样本非参数卡方检验(Kruskal-Wallis).采用SPSS13.0统计软件包进行数据分析。结果1.体外sTNFRⅡ-gAD相比sTNFRⅡ-Fc具有更强的TNF拮抗能力①体外TNF拮抗实验：结果显示,在0.22～1.1nM范围内相对于sTNFRⅡ-Fc, sTNFRⅡ-gAD表现出更强的TNF拮抗能力,差异显著(P<0.001)；②体外配体-受体复合物测定：结果表明在检测浓度下(600nM)TNF-sTNFRII-gAD复合物水平显著高于TNF-sTNFRII-Fc(F=596.284,P<0.001).2.sTNFRII-gAD减轻GaIN/LPS诱导的急性肝损伤①sTNFRII-gAD治疗对ALI生存率的影响：当造模后立即治疗时,阴性对照组造模后4.5-7h全部死亡,阳性药物组死亡主要出现在造模6h以后,其12h生存率近64%；而sTNFRII-gAD治疗组生存率达100%,与模型组比较具有显著统计学意义(P<0.001)。当造模后1h治疗时,sTNFRII-Fc组12h存活率为33.3%,大多数死亡发生在治疗后5～7h,而sTNFRII-gAD治疗组12h生存率达66.7%,并且死亡集中在治疗后8h左右；与模型组比较,两拮抗剂治疗组生存率显著升高并具有统计学意义(PsTNFRⅡ-Fc=0.009；PsTNFRII-gAD=0.001),而两TNF拮抗剂治疗组之间差异无统计学意义(P=0.127)。②sTNFRII-gAD治疗后肝损伤减轻：为考察治疗后肝脏受损情况,比色法测定血清ALT.AST以及H-E染色观察肝脏病理学改变。血清酶学结果显示,造模后立即治疗时,在2个不同时间点(2、5h)四组血清ALT差异有统计学意义(F=100.367,P<0.001)。其中两拮抗剂治疗组的ALT水平明显低于模型组水平且具有统计学意义(P<0.001)；造模后立即治疗时,四组间AST变化(2、5h)具有统计学差异(F=39.168,P<0.001),与正常组比较,模型组AST变化显著,具有统计学意义(P<0.001)而两种拮抗剂治疗组AST变化则无统计学意义(PsTNFRⅡ-Fc=0.077；PsTNFRII-gAD=0.379).延后1h治疗时5h各组血清酶含量显著高于2h水平,四组间ALT水平变化具有统计学差异(F=70.780,P<0.001)；延后1h治疗时四组AST变化组间差异具有统计学意义(F=38.089,P<0.001),其中sTNFRⅡ-gAD治疗组与模型组(P=0.011)、阳性药物组(P=0.002)之间差异具有统计学意义。宏观上,治疗后阴性组肝脏明显肿大、充血,在两种治疗模式下9造模后立即治疗、造模后1h治疗)三组肝脏/体重指数依次分别为0.049±0.001、0.061±0.002、0.052±0.002、0.050±0.001(F=104.711,P<0.001)和0.050±0.001、0.065±0.001、0.054±0.002、0.053±0.003(F=32.160,P<0.001),在这两种治疗模式下模型组脏脏/体重指数都明显高于其它三组,组间差异显著(P<0.001)。另外,在造模后立即治疗时,sTNFRⅡ-gAD治疗组肝脏/体重指数低于阳性对照组,差异具有统计学意义(P=0.041)而造模后1h延迟治疗时两组差异无统计学差异(P=1.000)。组织病理学方面,模型组肝损伤非常明显,肝细胞大面积损害,很少见到完整的肝组织结构。胞核消失,固缩、胞膜破坏、细胞间隙模糊,肝窦几乎消失,白细胞侵润明显。而在sTNFRⅡ-Fc、sTNFRII-gAD治疗组,肝细胞损伤情况明显较轻,尤以后者甚为明显。而且,造模后延迟1h治疗时肝脏损伤程度比造模后立即治疗严重。③sTNFRⅡ-gAD治疗后血清TNF水平升高而活性变化不明显：治疗后各组外周血TNF都保持在较高的水平,其中造模后立即治疗时模型组、阳性对照、实验药物组在2h、5h TNF分别为441.2±176.8、1114.4±276.6、1359.3±183.5pg/ml(F=62.059,P<0.001)和870.8±192.1、1830.1±78.6、1884.2±259.2pg/ml(F=193.902,P<0.001),显著高于正常对照水平(89.6±21.3pg/ml)；阳性对照组和实验药物组水平显著高于模型组,各自差异具有统计学意义；而两拮抗剂治疗组之间差异无统计学意义(P>0.005)。造模后延迟1h治疗后2h、5h三组TNF分别为510.9±45.2、1050.1±71.3、1258.6±98.7pg/ml和192.5±77.6、394.8±26.4、653.2±140.9pg/ml,而正常对照组TNF水平为89.6±21.3pg/ml,方差分析表明,组间差异具有统计学意义(F2h=193.902,P2h<0.001；F5h=27.436,P5h<0.001)。而且,sTNFRII-gAD治疗组TNF水平显著高于阳性对照组(P2h=0.028；P5h=0.029)。L929细胞毒性实验结果显示,当造模后立即治疗时,在治疗后2、5h,TNF拮抗剂治疗组TNF活性均明显低于阴性对照组,三组间TNF变化差异具有统计学差异(F=130.374,P<0.001)；当治疗后延迟1h治疗时,在相同时间点(2、5h)三组细胞毒作用分别为97%、80.54%、80.62%和80.13%、74.35%、74.86%,三组间TNF变化差异具有统计学意义(F=168.219,P<0.001),其中模型组TNF活性显著高于其它两TNF拮抗剂治疗组(P<0.001)。④sTNFRII-gAD明显抑制ALI过程中肝细胞凋亡为评价这两种TNF拮抗剂对ALI肝细胞凋亡作用的影响,我们分别进行TUNEL原位凋亡检测肝细胞的凋亡情况以及Western blotting法检测各组肝组织中Caspase-3的活化情况。TUNEL结果显示,此模型中肝细胞发生了大面积凋亡,PBS治疗组凋亡指数明显高于其它两个TNF拮抗剂治疗组而正常组小鼠则未能检测到肝细胞的凋亡。从蛋白水平看,阴性对照组5h时肝脏Caspase-3表达明显增强,并有其裂解片段的出现,这暗示Caspase-3被活化。结果还显示,虽然造模后立即治疗时两TNF拮抗剂治疗后Caspase-3表达无差异,但在造模后延迟1h治疗时sTNFRII-Fc治疗组Caspase-3裂解片段表达显著增强而sTNFRII-gAD治疗组则几乎不表达。3. sTNFRII-gAD对牛Ⅱ型胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎(CIA)的治疗作用①sTNFRII-gAD对大鼠CIA发病率、严重程度的影响自实验第10天开始每隔2天观察并记录各组的CIA发病情况,包括发病率、足爪肿胀以及临床评分,直至第3次治疗后2天(共4次,间隔8天)。结果显示,经三次治疗后模型组、阳性药物组及sTNFRII-gAD治疗组CIA发病率分别为100%、50%、37.5%,组间差异具有统计学意义(X2=7.156,P=0.028)。其中模型组发病率高于其它两拮抗剂治疗组,sTNFRII-gAD治疗组最低。排水法测定结果显示,随着时间推移模型组肿胀越加明显,其具体为1.00±0.12、1.16±0.15、1.32±0.08(ml)；而其它两组CIA动物的足爪体积分别是：0.91±0.06、0.99±0.13、1.08±0.21(sTNFRII-Fc治疗组)、0.90±0.09、0.97±0.17、1.03±0.19(sTNFRII-gAD治疗组)。三组间差异具有有统计学意义(F=4.725,P=0.020),但两TNF拮抗剂治疗组之间差异无统计学意义(P=1.000),而且阳性对照组与PBS治疗组之间无显著性差异(P=0.062)。根据普遍采用的CIA临床评分标准,每一组实验动物根据足爪的红肿情况获得一个评分。结果表明,各组其临床评分与疾病进展相关,而且sTNFRII-gAD治疗组临床评分统计量即平均秩次在各观察时间点均明显低于模型组和阳性对照组。②sTNFRII-gAD对CIA大鼠血清anti-CII水平的影响结果显示,三组anti-CII水平在治疗前差异不显著(分别为7306±1354、6654±914、6659±1552pg/ml；F=0.417,P=0.668)；治疗后PBS对照组为21127±3829pg/ml,阳性药物组为14209±172pg/ml, sTNFRII-gAD治疗组为8097±1248pg/ml,组间差异显著,具有统计学意义(F=39.235,P<0.001)。其中sTNFRII-gAD治疗组水平最低,显著低于PBS对照组(P<0.001)和阳性对照组(P=0.001)。③sTNFRII-gAD对CIA大鼠血清TNF水平的影响ELISA法分别测定各组实验动物的血清TNF水平。结果显示,除正常大鼠外(120.2±19.7pg/ml)其它三组的TNF水平均显著升高,治疗前水平分别为251.9±14.7、255.5±25.9、257.4±13.6(pg/ml),四组间比较差异具有统计学意义(F=62.047,P<0.001)；治疗后阴性对照组TNF水平有一定的下降,而其它两TNF拮抗剂治疗组则明显高于治疗前,三组结果分别为228.9±33.3、319.7±28.4、358.1±18.3(pg/ml),组间差异具有统计学意义(F=84.948,P<0.001)。其中治疗后两拮抗剂治疗组水平显著高于PBS对照组(P<0.001)而拮抗剂治疗组之间差异无统计学意义(P=0.187)。④sTNFRII-gAD对CIA大鼠血清IL-17A的影响相对于正常组(12.3±1.10pg/ml),治疗前各造模组IL-17A水平显著升高,三组IL-17A水平分别为20.7±2.7、20.0±2.4、20.8±1.9,组间差异具有统计学意义(F=19.260,P<0.001)；治疗后阴性对照组IL-17A升至36.1±4.4pg/ml,而sTNFRII-Fc、sTNFRII-gAD治疗组分别是21.3±2.9、19.44±1.2pg/ml,与正常组比较组间差异具有统计学意义(F=75.865,P<0.001),阴性对照组水平显著高于另外两组(P<0.005),而两TNF拮抗剂处理组之间差异无统计学意义(P=0.700)。⑤sTNFRII-gAD对CIA大鼠外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg的影响流式检测显示,CIA与Treg数量的下降相关。治疗前各组大鼠外周血Treg水平显著低于正常组(P<0.05),四组间差异具有统计学意义(F=22.253,P<0.001),而这三组间相互差异无统计学意义(P>0.05)。经三次治疗后,模型组Treg徘回在治疗前水平甚至有所降低尽管前后差异无统计学意义(t=0.756,P=0.492)；而两种TNF拮抗剂治疗组水平趋于恢复至正常组水平,各自与其治疗前水平相比,差异显著(P<0.001),与正常组比较差异无显著性(P>0.05)。治疗后四组间差异具有统计学意义(F=131.886,P<0.001)。⑥sTNFRII-gAD治疗中CIA大鼠病理组织学及影像学变化经脱臼处死大鼠后,部分大鼠的踝关节立即放入10%中性甲醛溶液中固定用于组织病理学检查,部分大鼠自膝关节以下截取用于检查踝关节影像学变化。H-E染色表明,相对于正常对照,阴性对照组踝关节出现滑膜腔变窄、弥漫性白细胞侵润、软骨增生增厚、软骨成骨界限模糊、滑膜破损严重,而sTNFRII-Fc和sTNFRII-gAD治疗组则明显较轻,在sTNFRII-Fc组有少许的软骨增厚、少量白细胞侵润而sTNFRII-gAD的组织病理学则近乎于正常组。影像学方面,PBS组有明显的踝关节软组织肿胀以及骨质破坏而其它两组则无此现象。结论本研究首先经体外实验证实sTNFRII-gAD能有效地结合并拮抗TNF,并且其拮抗能力高于已商品化的同类制剂sTNFRII-Fc。在GaIN/LPS诱导的ALI治疗实验中,该融合蛋白通过竞争性结合体内过度生成的TNF而抑制该模型所致的急性肝损伤作用并在一些方面优于sTNFRII-Fc,如体外TNF拮抗作用、抑制ALI过程中AST升高以及脏脏/体重指数。其机制可能是通过结合TNF而抑制肝细胞表面相应受体活化最终阻碍细胞凋亡。另外,本研究表明,sTNFRII-gAD通过拮抗体内慢性炎症产生的TNF生物活性进而抑制Th17细胞分化以及促进外周Treg恢复有效抑制或缓解Ⅱ牛胶原诱导的大鼠关节炎。因此,sTNFRII-gAD作为一种新型的TNF拮抗剂,在临床治疗一些与TNF过度表达相关疾病过程中将具有相当的潜力。而且本研究还表明,通过基因重组技术构建的细胞因子受体-gAD融合蛋白拮抗相应炎症细胞因子从而预防或治疗相关因子引起的一些炎症性疾病的可行性,为抗细胞因子治疗提出新的思路。