大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆根腐病是大豆生产上的主要病害之一,每年给全世界的大豆生产造成重大的经济损失。如何防控大豆疫霉根腐病是生产中面临的重要问题。在大豆疫霉的生活史中,其无性繁殖可以产生孢子囊,孢子囊在合适的条件下释放大量游动孢子并进行传播,导致大豆发病成灾。在田间传播过程中,大豆疫霉释放游动孢子识别寄主根部分泌的化学物质,依靠趋化性定向游动,从而定殖到大豆根部。因此,探究大豆疫霉孢子囊的发育、游动孢子的释放及其趋化性等无性繁殖过程中的分子机制,有助于我们发现该类病害防控的分子靶标,为抗病分子设计奠定基础。在本实验室前期的研究中,已经对大豆疫霉无性繁殖过程中相关的分子机制进行了初步的研究。发现G蛋白信号途径中的G蛋白α亚基编码基因PsGPA1沉默后显著影响游动孢子的趋化性,G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR)编码基因PsGPR11沉默突变体的休止孢萌发率与野生型相比下降40%左右,另一个基因PsGK4则显著影响无性发育时休止孢的萌发以及游动孢子的趋化性;MAPK信号通路中的MAPK编码基因PsMPK7沉默后,休止孢萌发后芽管畸形,同时对大豆的致病力也明显下降,而PsMPK1则参与调控大豆疫霉的菌丝生长和游动孢子形成;沉默核质转运过程相关的一个亲核蛋白编码基因PsIMPA1后,孢子囊的萌发率及致病力明显下降;SNARE蛋白家族基因PsSYP6的沉默显著影响孢子囊的产量及其正常发育。为了进一步鉴定更多的大豆疫霉无性繁殖相关因子,并探索他们之间的相互关系,本研究以前期鉴定的PsGK4和PsIMPA1为基础,拟分别筛选其相关的互作蛋白和转录水平上有联系的相关基因。主要研究内容如下:大豆疫霉G蛋白偶联受体PsGK4的互作蛋白筛选。前期研究发现PsGK4对游动孢子的游动性、异黄酮的趋化性和病菌的致病力有重要贡献,且PsGK4在细胞中定位在囊泡结构上。在此基础上进一步筛选PsGK4的互作蛋白可能对了解其相关的信号网络,理解疫霉菌无性繁殖和游动孢子趋化性的分子机制等具有重要的意义。本研究通过免疫共沉淀的方法筛选大豆疫霉PsGK4的互作蛋白,共获得了 70个候选互作蛋白。由于PsGK4的全长蛋白难以表达,我们最终使用其N端57个氨基酸的亚结构域(GPCR七次跨膜域中第一个囊泡膜外的肽段)。通过被鉴定肽段的匹配数及对候选互作蛋白的功能预测,我们最终挑取了 3个蛋白进行深入的研究,包括:Ps330899、Ps359771和Ps247465。其中Ps359771蛋白含有一个烯醇化酶功能域(Enolasedomain,因此将其命名为PsEnol),烯醇化酶在真核细胞表面可以作为人体凝血酶原的受体参与调控肌肉生成和瘤组织的发展;Ps247465蛋白含有一个Sec23 domain(命名为PsSec23),该类蛋白是COPII型囊泡外被蛋白复合体的组分之一,可以介导囊泡从内质网向高尔基体的定向运输;Ps500558蛋白含有一个Rab-GTPase-TBC domain(命名为PsRGTC),可能与囊泡蛋白复合体互作来调控囊泡的定向运输过程。通过原核诱导表达在体外分别进行上述蛋白与PsGK41-57aa肽段的GST Pull-down互作验证,初步结果中均未发现这些蛋白与PsGK41-57aa有互作关系。该实验有待于通过优化蛋白表达量、蛋白表达的完整性或使用其他互作分析方法等进一步验证。其他筛选到的候选互作蛋白也有待进一步分析验证。通过大豆疫霉PsIMPA1基因沉默突变体的转录组分析筛选可能与无性繁殖相关的基因。亲核蛋白是真核细胞中十分保守的一类蛋白质家族,负责细胞中的核质转运过程,即将细胞质中的大分子物质运输到细胞核中,从而调控特定基因的转录表达,或将转录的mRNA运输到细胞质中进行蛋白翻译。实验室前期研究发现PsIMPA1沉默后,突变体不能产生孢子囊及游动孢子,且侵染大豆过程中不能有效清除活性氧,导致致病能力显著下降。本研究利用RNA-seq探究了大豆疫霉PsIMPA1基因沉默突变体在菌丝阶段和孢子囊阶段中(与野生型相比)基因表达模式的变化。结果发现大豆疫霉PsIMPA1的沉默显著影响了包括G蛋白信号通路、MAPK信号通路和SNARE蛋白家族等相关基因的显著下调表达,其中部分基因功能已在实验室前期研究中被鉴定,这也从侧面反映了测序数据的可靠性。在测序数据中也得到大量转录因子的差异表达,其中包括常见的bZIP、C2H2、HSF等转录因子家族。