目的和意义结直肠癌(colorectal carcinoma, CRC)是我国第三位最常见的恶性肿瘤,并且近年来其发病率呈逐年上升趋势。在结直肠癌发病早期,90%的病人可通过手术治疗治愈,然而,大部分病人在确诊时已是疾病晚期,预后差。因此,加强结直肠癌机制的研究,寻找预防和治疗的有效途径,是结直肠癌研究的重要内容。MicroRNA(miRNA)是一种大小约17～25个核苷酸(nucleotide,nt)的非编码单链小分子RNA,广泛存在于真核生物中,是一组不编码蛋白的短序列RNA。miRNA通过与靶基因mRNA的3’UTR非编码区(3’untranslated region,3’UTR)互补匹配导致该mRNA的降解而发挥调节作用。在哺乳动物中发现大约1000种miRNAs, miRNA具体的生理病理功能,目前仍在探索之中。相关文献显示：1.miRNA可扮演着癌基因或抑癌基因的角色；2. miRNA通过调控细胞迁移、侵袭、细胞增殖、上皮间质转化(EMT)、血管生成及细胞凋亡参与肿瘤的转移等进程；3. miRNA可作为生物学标记物。miRNA参与生物体发育、细胞增殖、分化和凋亡等多种生物过程,并且miRNA表达失调可能参与肿瘤的病理过程。近年来,越来越多的证据表明,在结肠癌的发展过程中伴随着miRNA的表达失调。有些miRNA通过调控癌基因或抑癌基因在结肠癌中起作用,有些癌基因或抑癌基因通过调控miRNA发挥作用。MiRbase数据库显示,hsa-mir-30b(miR-30b)全长21nt,在多种组织中泛表达,其表达无组织特异性。研究显示,miR-30b在多种实体瘤的发生发展中表达失调。Wszolek等用微阵列芯片及实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)比较侵袭性膀胱癌与非侵袭性膀胱癌中miRNA表达的变化,发现miR-30b, miR-31, miR-141, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-205, miR-21在侵袭性膀胱癌组织中表达明显下降,miR-99a在非侵袭性膀胱癌组织中表达明显升高,体外侵袭实验进一步证实miR-30b, miR-31, miR-141与膀胱癌细胞的侵袭性具有明显相关性。miR-30b可通过靶基因影响肿瘤的侵袭性。在黑色素瘤中,Gaziel-Sovran等通过微阵列芯片发现,miR-30b/30d在黑色素瘤中表达升高,并且其高表达水平与肿瘤分期、转移潜能相关、miR-30b/30d高表达组较低表达组复发率高,总体生存期短。外源性过表达miR-30b/30d可促进黑色素瘤细胞的侵袭及免疫抑制,其机制是miR-30b/30d靶向抑制转移酶GALNT7,引起免疫抑制因子IL-10合成增多,降低免疫细胞的激活及募集,促进细胞侵袭。由此可见,miR-30b在多种肿瘤中发挥了重要作用。经Pubmed等数据库检索,未检索到miR-30b在结肠癌中相关研究报道。基于miR-30b的研究现状,本研究首先通过实时定量RT-PCR鉴定结肠癌组织中miR-30b的表达特点,初步探讨miR-30b在结肠癌中的表达情况。外源性改变miR-30b的表达水平观察其对结肠癌细胞增殖与凋亡的影响,结合生物信息学预测及双荧光素酶报告系统验证其靶基因,阐明miR-30b在结肠癌发生发展中所扮演的角色,为深入理解结肠癌发病的分子机制和寻找新的分子靶向治疗靶点提供实验基础。材料和方法1.临床标本收集收集南方医科大学附属南方医院2005年1月至2010年12月结直肠癌及对应癌旁组织43例,采集前均通过南方医科大学附属南方医院医学伦理委员会批准及患者知情同意。所有标本均经病理诊断确诊为结肠癌。所有患者术前尚未接收放化疗治疗。2.细胞培养人结直肠癌细胞HCT116、SW480采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基,293FT细胞采用5%DMEM培养基,在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下传代培养,细胞状态良好时用于实验。3.载体构建(1)慢病毒载体pLVTHM/miR-30b:以人结直肠癌细胞基因组DNA为模板,扩增miR-30b前体及侧翼序列(510bp),将该片段克隆至pLVTHM,得到重组质粒pLVTHM/miR-30b。(2) PGL3-SOX43’UTR和PGL3-SOX43’UTR-Mut:以人结直肠癌细胞基因组DNA为模板,扩增SOX43’UTR(492bp),将该片段克隆至PGL3-Basic vector,得到种族质粒PGL3-SOX43’UTR,将该重组质粒进行点突变,得到突变质粒PGL3-SOX43’UTR-Mut。4.慢病毒包装、浓缩滴度测定采用碳酸钙沉淀法,将慢病毒表达载体和包装载体共转染293FT细胞,培养48-72h后收集病毒上清,超速离心后进行浓缩纯化,倍比稀释法滴度测定。5.细胞转染(1)瞬时转染：按LipofectamineTM2000试剂说明书进行。(2)慢病毒感染：将慢病毒悬液感染结肠癌细胞,利用流式细胞仪分选获得GFP+细胞,分别建立过表达miR-30b的结肠癌细胞株HCT116/miR-30b和SW480/miR-30b。(3) miRNA与质粒共转染：按LipofectamineTM2000试剂说明书进行。24孔板中miRNA的用量为50nM,重组质粒PGL3-SOX43’UTR和PGL3-SOX43’UTR-Mut用量为0.5μg,pRL-SV40用量为0.05μg。6.实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)抽提细胞和组织总RNA,按All-in-OneTM First-Strand cDNA Synthesis Kit及All-in-OneTM qPCR Mix说明书操作,检测miR-30b的表达：按逆转录试剂盒(TAKARA)及SYBR@Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)说明书操作,检测SOX4mRNA的表达。通过相对定量以2-ΔΔCt值代表基因的相对表达强度。7.细胞生物学实验包括MTT实验,平板克隆形成实验,软琼脂克隆形成实验检测miR-30b对结肠癌细胞增殖的影响。Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测miR-30b对结肠癌细胞凋亡的影响(Annexin Ⅴ Flous Staining Kit(Roche))8.Western blot抽提细胞总蛋白,BCA法蛋白定量,10%SDS-PAGE电泳、转膜、免疫杂交、ECL化学发光。9.双荧光素酶报告基因检测按Dual-Luciferase(?)Reporter Assay System(Promega)说明书进行操作,将荧光素酶报告基因载体瞬时转染48h后,将细胞裂解后检测,以Firefly Luciferase和Renilla Luciferase活性的比值作为荧光素酶的相对活性10.统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。miR-30b在癌组织及相应的癌旁组织中表达比较采用配对样本Wilcoxon符号秩检验。MTT实验采用析因设计的方差分析。平板克隆、软琼脂克隆形成实验,Annexin Ⅴ-FITC/PI双标记流式细胞术、双荧光素酶报告基因实验均采用两独立样本的t检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.miR-30b在结肠癌中低表达采用实时定量PCR法检测43例结肠癌组织及对应癌旁组织中miR-30b的表达,结果显示,结肠癌组织中miR-30b的表达明显下降。癌组织中miR-30b相对表达的中位数为0.149,四分位数间距为0.030至0.309；癌旁组织中miR-30b的相对表达中位数为0.252,四分位间距为0.078至0.630。配对样本的Wilcoxon符号秩检验示,两者差异有统计学意义(P=0.001)。2. miR-30b对结肠癌细胞生物学特性的影响瞬时转染miR-30b mimics和inhibitor,荧光定量PCR检测miR-30b的表达,结果显示HCT116和SW480在转染miR-30b mimics后,miR-30b的表达分别增高了4.774倍(P=0.001)和7.107倍(P=0.001)：转染miR-30b inhibitor后,miR-30b的表达分别下降了83%(P=0.001)和78%(P=0.001)。以上结果表明,通过瞬时转染miR-30b mimics或miR-30b inhibitor可有效上调或下调miR-30b的表达。通过MTT实验检测miR-30b表达改变对结肠癌细胞体外生长能力的影响,结果显示,转染miR-30b mimics5day后,HCT116和SW480细胞的生长速度分别降低了34.4%和22.5%,而转染miR-30b inhibitor5day后,两种细胞的生长速度分别加快了34.3%和33.8%。通过构建miR-30b’慢病毒表达载体,建立稳定细胞株HCT116/miR-30b和SW480/miR-30b,进行平板克隆形成实验。平板克隆形成实验结果显示,对照组细胞HCT116/pLVTHM克隆形成数为26.2±2.8个,HCT116/miR-30b组克隆形成数为11.7±1.1个,差异有统计学意义(t＝8.652,P=0.001)；对照组SW480/pLVTHM组克隆形成数为23.2±2.2个,SW480/miR-30b细胞克隆形成数为12.5±0.8个,差异有统计学意义(t=7.917,P=0.01)。外源性沉默miR-30b可增强结肠癌细胞的克隆形成能力。软琼脂克隆形成实验结果显示,对照组细胞HCT116-plVTHM克隆形成数为25.7±2.6个,HCT116/miR-30b组克隆形成数为10.6±1.2个,差异有统计学意义(t=9.133,P=0.01)；对照组SW480-pLVTHM组克隆形成数为29.2±2.5个,SW480/miR-30b细胞克隆形成数为14.8±1.0个,差异有统计学意义(t=9.263,P=0.01)。外源性沉默miR-30b后可增强结肠癌细胞的克隆形成能力。瞬时转染miR-30b mimics或inhibitor后,Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测miR-30b对细胞凋亡的影响。结果显示,对照组细胞HCT116Mimics Negative Control (HCT116Mimics NC)凋亡率为(2.42±0.28)%,HCT116Mimics组细胞凋亡率为(4.56±0.45)%,差异有统计学意义(t=-6.994,P=0.002)；对照组HCT116Inhibitor Negative Control (HCT116Inhibitor NC)组细胞凋亡率为(3.36±0.17)%, HCT116Inhibitor组细胞凋亡率为(2.57±0.22)%,差异有统计学意义(t=4.922,P=0.008)。以上结果提示,miR-30b参与调控结肠癌细胞凋亡：过表达miR-30b可促进结肠癌细胞凋亡,沉默miR-30b表达能抑制结肠癌细胞凋亡。上述结果表明,过表达miR-30b可抑制结直肠癌细胞的体外增殖能力,促进细胞凋亡；沉默miR-30b可增强结直肠癌细胞增殖,抑制细胞凋亡。以上结果提示,miR-30b在结肠癌中扮演着候选抑癌基因的角色。3.在结肠癌细胞中,SOX4为miR-30b的靶基因。利用miRBase、TargetScan和miRanda三大数据库对miR-30b进行靶基因预测,3个数据库均预测SOX4(SRY (sex determining region Y)-box4)为miR-30b的靶基因。构建重组质粒PGL3-SOX43’UTR和突变质粒PGL3-SOX43’UTR-Mut。将PGL3-SOX43’UTR、PGL3-SOX43’UTR-Mut质粒与miR-30b mimics或inhibitor共转染HCT116细胞后,检测荧光素酶活性,发现pGL3-SOX43’UTR+mimics NC的相对活性为0.689±0.057, pGL3-SOX43’UTR+miR-30b mimics的相对活性为0.327±0.004,差异有统计学意义(t=10.815, P<0.001)。 pGL3-SOX43’UTR+inhibitor NC组的相对活性为0.604±0.017, pGL3-SOX43’UTR+miR-30b inhibitor的相对活性为0.804±0.041,差异有统计学意义(t=-7.920,P=0.001)。以上结果表明,miR-30b通过与SOX43’UTR特异性结合抑制SOX4的表达。qRT-PCR和western blot法检测HCT116/pLVTHM和HCT116/miR-30b中SOX4表达情况,结果表明,相对于HCT116/pLVTHM, SOX4mRNA和蛋白水平在HCT116/miR-30b中明显下调；沉默miR-30b可显著上调SOX4mRNA和蛋白水平。上述结果进一步证实,SOX4为miR-30b的靶基因。结论1.miR-30b在结肠癌组织中低表达。2. miR-30b参与了结肠癌的发生发展：外源性过表达miR-30b可抑制结直肠癌细胞的体外增殖能力,促进细胞凋亡；沉默miR-30b可增强结直肠癌细胞增殖,抑制细胞凋亡。上述结果提示,miR-30b在结肠癌中扮演着候选抑癌基因的角色。3.在结肠癌细胞中,SOX4为miR-30b的靶基因。