农杆菌介导的花生遗传转化体系的优化研究

来源 :河北农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:baoxiuli
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花生的品质和产量极易受到生物和非生物逆境的影响。栽培种花生缺少逆境抗源,使花生逆境抗性的常规育种受到限制。随着分子生物学的发展,利用基因工程方法打破花生物种间的遗传障碍,将优良目的基因定向转移到花生中以提高其抗性、改良其品质成为可能。因此,开展花生转基因育种具有重要现实意义。为建立高效、稳定的遗传转化体系,本研究以花生品种麻油1-1、弗落蔓生和濮花23号的胚小叶和子叶节为外植体受体,通过优化花生再生体系及农杆菌介导的遗传转化体系,进行外源Bar基因的转化,为花生的遗传转化提供良好的技术基础。主要研究结果如下:  1.研究了不同浓度的卡那霉素(Kan)对花生胚小叶生长发育、丛生芽分化和丛生芽生根阶段的影响。结果表明,胚小叶丛生芽分化的Kan筛选浓度依次为:弗落蔓生150 mg/L、麻油1-1100 mg/L和濮花23号50 mg/L;丛生芽生根的Kan筛选浓度为:弗落蔓生20mg/L、麻油1-120 mg/L和濮花23号10 mg/L。三个品种中,弗落蔓生对Kan的敏感性较低,而濮花23号表现对Kan很强的敏感性。说明不同基因型花生对Kan的敏感性不同。  2.研究了高效诱导伸长苗生根的激素组合。结果表明生根培养基1/2 MS+1mg/L NAA+0.2 mg/L IAA诱导生根率最高,达100%。  3.初步探索了以花生子叶节为外植体的再生转化体系。花生子叶节再生对Kan较敏感,芽诱导培养基中Kan的最适浓度为100 mg/L。品种麻油1-1和弗落蔓生的子叶节外植体在培养基MSB5+6 mg/L6-BA+2 mg/L2,4-D中诱导芽效果最好。品种濮花23号子叶节的最佳诱导芽培养基是MSB5+10 mg/L6-BA+2 mg/L2,4-D。表明基因型对再生率有很大的影响,不同花生品种不定芽的形成有明显的差异。  4.利用农杆菌介导的方法,研究了花生胚小叶遗传转化过程中菌液浓度、侵染时间及共培养时间对抗丛生芽效率的影响。结果表明3个因素均对抗丛生芽诱导率有显著影响,其诱导效应依次是共培养时间>侵染时间>菌液OD值。根据研究得到农杆菌介导花生胚小叶转化的最佳条件是:菌液OD值为0.5,侵染时间25 min,共培养时间3d。  5.通过对转化条件的优化研究,提出了农杆菌EHA105介导的花生基因转化的技术流程:选取大小一致饱满的花生种子,消毒之后在萌发培养基上MSB5+6 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA进行预培养,之后将预培养8d的胚小叶进行侵染转化,用农杆菌菌液OD600=0.5的重悬菌浸染25 min,然后放在铺有滤纸的共培养基MSB5+5 mg/L AS中进行暗培养3d,转接到丛生芽诱导培养基上MSB5+6 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA+300 mg/L Cef+50 mg/L Kan上,每20 d继代1次,继代1~2次后,转接到伸长培养基中MSB5+4 mg/L6-BA+0.2 mg/LNAA+250 mg/L Cef+100 mg/L Kan或MSB5+0.2 mg/L NAA+4 mg/L6-BA+2 mg/LGA3+250 mg/L+100 mg/L Kan中,经过1~2次继代,待伸长到3~4 cm转入生根培养基1/2MS+1 mg/L NAA+0.2 mg/L IAA+20 mg/L Kan上生根培养,进行15d的生根培养炼苗移栽。  6.Bar基因筛选剂草丁磷(PPT,Phosphinothricin)叶面涂抹的适宜浓度均为75 mg/L。利用优化的条件,将Bar基因导入花生品种麻油1-1中,获得经PCR检测和表型鉴定的后代转基因植株13株,最终转化率达到6.8%。
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