论文部分内容阅读
背景：结肠癌的转移、复发严重制约着临床疗效,目前对于其机制尚不明确。肿瘤干细胞理论认为,肿瘤干细胞的自我更新和分化能力决定着肿瘤的转归,介导其转移、复发等行为。核转录因子KLF4(Kruppel-like factor4)在维持干细胞的自我更新和分化过程中发挥关键作用。而正常干细胞与肿瘤干细胞极为相似,所以有必要明确KLF4在正常干细胞与肿瘤干细胞中是否存在相同或相似的调控机制。在结肠癌中KLF4被认为是抑癌基因,但是这些报道都基于临床及普通结肠癌细胞研究,目前还未见KLF4在结肠癌肿瘤干细胞中的表达及功能研究。我们发现,KLF4高表达于富集肿瘤干细胞的细胞群中。考虑到KLF4在维持干细胞自我更新过程中发挥的关键作用,则其在结肠癌干细胞中是继续发挥抑癌效应还是作为原癌基因维持其自我更新?目的：明确KLF4表达变化对富集结肠癌干细胞的球细胞恶性行为的影响,以期揭示KLF4在结肠癌转移、复发中的作用。方法：Real-time PCR、Western-blot检测结肠癌细胞系及正常结肠上皮细胞FHC中KLF4表达情况。将结肠癌DLD-1细胞行无血清培养获得DLD-S球细胞,检测其中KLF4、结肠癌干细胞基因的表达；Transwell检测转移、侵袭能力；裸鼠皮下成瘤实验及软琼脂克隆、平板克隆实验检测体内外成瘤能力；CCK-8法检测耐药能力变化。免疫磁珠法分选CD133+及CD133-细胞,Real-time PCR检测其中KLF4表达差异。免疫荧光检测KLF4与CD133在DLD-1及DLD-S中的表达。设计KLF4shRNA’慢病毒载体,转染球细胞后检测KLF4、结肠癌干细胞基因的表达及上皮间质转化相关基因表达变化；流式细胞术检测CD133+细胞比例变化；细胞再次行无血清培养检测其自我更新能力差异；再次检测细胞转移、侵袭、体内外成瘤能力、耐药能力变化。结果：相对于正常结肠上皮FHC,结肠癌中KLF4表达量低(P<0.05)。相比DLD-1,DLD-S中KLF4、结肠癌干细胞基因表达明显升高(P<0.05); DLD-S细胞已发生上皮间质转化(P<0.05)；球细胞表现出更强的侵袭、转移、耐药及体内外成瘤能力(P<0.05)；相较于CD133-细胞,CD133+细胞中KLF4也明显升高(P<0.05)；免疫荧光也证实KLF4与CD133共同表达在DLD-S细胞中；沉默DLD-S中KLF4表达后,KLF4、CD133、CD166、Lgr5、ALDH1表达均下降(P<0.05)；CD133+细胞比例下降(P<0.05)；侵袭、转移、耐药及体内外成瘤能力均被削弱(P<0.05); EMT进程被抑制；成球能力削弱。结论：KLF4高表达于富集结肠癌肿瘤干细胞的细胞群；KLF4很可能作为原癌基因参与调控肿瘤干细胞的恶性生物学行为,与KLF4作为结肠癌抑癌基因的传统观点不同。