在酸性土壤地区,植物铝毒害是限制紫花苜蓿生长的主要因素。这是因为,酸性土壤中所含的高浓度铝离子会严重抑制作物根系的生长,导致减产甚至死亡。近年来,尽管国内外对植物的耐铝机制进行了较为广泛的研究,但对耐铝关键基因及其分子机制等仍还不是很清楚。鉴于此,本研究拟通过对紫花苜蓿铝胁迫消减基因文库的筛选与鉴定,来初步揭示一些与紫花苜蓿耐铝相关的基因,以期为后期耐铝性紫花苜蓿种质的培育奠定基础。主要研究结果如下:试验一:目的:从紫花苜蓿铝胁迫抑制消减文库中筛选出耐铝相关基因。方法:采用DIG标记探针的改良Differential Screening技术筛选紫花苜蓿铝胁迫抑制消减文库;并对筛选出的230个阳性克隆进行测序,共获得75个有效序列。包括19个新的EST序列和56个与已知基因具有同源性的EST序列,并把这些序列登到dbEST数据库。结果:经BLASTX分析表明,这些EST所编码的基因在铝胁迫中发挥着的作用,这些EST编码的基因上调有苹果酸脱氢酶、果胶甲酯酶抑制因子、N-末端热激蛋白、海藻糖磷酸合成酶、中性/碱性蔗糖转化酶、过氧化物酶、泛素关联蛋白、几丁质酶、ABC转运体、细胞色素P450;下调有膜家族蛋白、衰老相关蛋白、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、半乳糖结合蛋白、延伸因子和促分泌膜载体蛋白等。而本实验中筛选出编码苹果酸脱氢酶的基因在植物的耐铝方面起着重要的作用,这是因为苹果酸脱氢酶(MDH)可引起草酰乙酸盐的氧化作用以形成苹果酸盐,苹果酸是植物体内参与C4循环、景天酸循环等众多代谢途径的关键代谢物。苹果酸含量提高的途径主要来自植物体内合成的提高。增加植物体内苹果酸的含量,从而显著提高植物体的耐酸性以及对铝毒的抗性。其它的EST所编码的蛋白涉及到抗氧化作用、信号的传导、发育和能量代谢等多种生理过程。这些蛋白也广泛参与植物的其他应激反应,与其他生物性和非生物性胁迫诱导相关。试验二:目的:检测耐铝相关基因的mRNA表达量。方法:利用荧光实时定量技术检测用Differential Screerling技术筛选得到的基因的表达量。结果:蛋白激酶家族蛋白和磷酸烯葡萄糖脱氢酶的表达量分别降低了2.75和6.54倍,EST17所编码的转移蛋白因子的表达量增加了34.54倍,而没有同源序列的EST16表达量降低了16.68倍。表明转移蛋白因子和EST16在紫花苜蓿的耐铝机制中可能起着重要的作用。