论文部分内容阅读
目的:本研究给予大鼠不同时长尾吊模拟失重暴露,通过检测大鼠肠道菌群的变化、肝脏氧化应激和炎症反应水平以及肝脏损伤情况,明确模拟失重环境对大鼠肠道菌群的影响和对大鼠肝脏的损伤作用,探讨模拟失重环境所致肝损伤的潜在机制,为防治失重所致健康损害提供科学依据。方法:实验动物选择体重（200±20）g的雄性SPF级Wistar大鼠,共20只。适应性喂养1周后,被随机分成4组,分别为:对照组、尾吊4周组、尾吊5周组和尾吊6周组,每组5只,采用尾吊模拟失重。各观察终点结束尾吊,禁食24小时。刺激大鼠肛门部,无菌收集粪便,称量大鼠体重,使大鼠麻醉后,采集全血,解剖并取肝脏。大鼠肝脏中病理变化均采用HE染色观察;血浆和肝脏中的白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）水平、白介素-6（interleukin-6,IL-6）水平和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）水平均采用ELISA测定;血浆和肝脏中的肝功能指标丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）水平,氧化应激指标丙二醛（malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）的水平均采用比色法测定;荧光显色法检测大鼠肝组织中活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平;采用Real Time q PCR检测大鼠肝脏损伤相关基因TLR4、NF-κB-p65、NOD2 m RNA表达水平,采用免疫组化检测肝脏损伤相关蛋白TLR4、NF-κB-p65、NOD1的表达;采用16S r RNA高通量测序检测大鼠肠道菌群的丰度及构成。采用IBM SPSS 24.0软件进行统计分析。计量资料的统计分析方法为两种,符合正态分布的用?±s表示,使用单因素方差分析进行多组间差异比较,用Tukey法后续进行两两比较;采用Spearman秩相关检验分析炎症相关基因与炎性因子及氧化应激指标的相关性,肠道菌群与炎症相关指标及氧化应激指标的相关性;Alpha多样性和Beta多样性用于研究肠道微生物群落多样性。样本间的差异性并可视化样本的聚类使用主坐标分析（principal coordinates analysis,PCo A）,LEf Se分析用于样本之间的比较从而找到各组之间具有显著差异的肠道菌群分析;结果可视化使用R软件（4.2.2）,检验水准设定为α=0.05。结果:1.模拟失重对大鼠的一般损伤:各尾吊组大鼠体重显著低于对照组（P＜0.05）;尾吊6周组大鼠肝脏系数明显低于其他各组（P＜0.05）。2.模拟失重对大鼠肝组织病理损伤:尾吊4周组出现肝细胞肿胀,尾吊5周组出现肝细胞索排列紊乱,尾吊6周组肝细胞呈颗粒变性增多,并出现细胞坏死。3.模拟失重对大鼠肝功能的影响:尾吊6周组大鼠血浆ALT活力明显高于对照组,肝组织ALT活力明显低于各尾吊组（P＜0.05）;尾吊6周组和尾吊5周组大鼠血浆AST活力明显高于对照组（P＜0.05）。4.模拟失重对大鼠血浆及肝脏氧化应激的影响:尾吊6周组大鼠血浆及肝脏中ROS、MDA、SOD和GSH均显著高于对照组（P＜0.05）。5.模拟失重对大鼠血浆及肝脏炎性因子的影响:尾吊6周组大鼠血浆及肝脏IL-1β水平显著高于其他各组（P＜0.05）;尾吊6周组大鼠血浆IL-6水平显著高于尾吊5周组,尾吊5周组肝脏中IL-6水平明显高于尾吊4周组（P＜0.05）;尾吊4周组和6周组大鼠大鼠血浆TNF-α水平均高于对照组（P＜0.05）,肝脏组织中TNF-α含量随着尾吊时间的延长逐渐降低,各尾吊组均显著低于对照组（P＜0.05）。6.模拟失重对大鼠血浆及肝脏炎性基因的影响:尾吊组大鼠肝脏TLR4m RNA表达水随着尾吊时间的延长逐渐降低,6周组显著低于对照组（P＜0.05）;尾吊组大鼠肝脏NF-κB-p65 m RNA表达水平随着尾吊时间的延长逐渐增加,6周组显著高于对照组（P＜0.05）。尾吊4周组和5周组大鼠肝脏NOD2 m RNA表达水平显著低于对照组,6周组显著高于对照组（P＜0.05）。7.模拟失重对大鼠血浆及肝脏相关蛋白的影响:尾吊组大鼠肝脏TLR4、NF-κB-p65和NOD1蛋白表达量显著升高。8.炎症相关基因与氧化应激指标的相关性分析显示:NF-κB-p65与ROS、MDA、GSH均呈显著正相关,TLR4与ROS、MDA、SOD、GSH均呈显著负相关（P＜0.05）,NOD2与ROS、SOD、GSH均呈显著正相关（P＜0.05）。9.模拟失重对大鼠肠道菌群的影响:尾吊组组大鼠肠道菌群构成与对照组有显著差异（P＜0.05）,消化链球菌科和罗姆布茨菌属显著降低（P＜0.05）,理研菌科、另枝菌属和双歧杆菌显著升高（P＜0.05）。10.罗姆布茨菌属与大鼠肝脏ROS、MDA、SOD、GSH呈负相关（P＜0.05）;大鼠血浆TNF-α与消化链球菌科、罗姆布茨菌属呈显著负相关（P＜0.05）,与链状双歧杆菌呈显著正相关（P＜0.05）;TLR4与消化链球菌科、罗姆布茨菌属呈正相关（P＜0.05）。结论:1.模拟失重环境可引起大鼠体重降低以及肝脏脏器系数改变,并出现肝脏病理损害和肝功能改变。2.模拟失重环境可诱发大鼠肝脏氧化应激和炎症反应,损伤肝脏。3.模拟失重环境可引起大鼠肠道有益菌数量降低和致病菌数量升高,出现肠道菌群稳态失调。肠道菌群稳态失调可能通过引发大鼠肝脏的炎性反应和氧化应激损伤大鼠肝脏。