基于网络药理学探讨益肾清利和络颗粒治疗慢性肾脏病的作用机制

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目的:运用网络药理学及5/6肾切除大鼠模型,结合肠道微生态,探究益肾清利和络颗粒(YQHG)对慢性肾脏病(CKD)的治疗作用及可能的作用机制。方法:应用TCMSP数据库和大量文献检索筛选出YQHG包含的活性化学成分,通过TCMSP、STITCH、Swiss Target Prediction和PubChem数据库获得其活性化合物及对应的蛋白靶点。同时通过GeneCards、OMIM、DisGeNET、TTD、Mala Cards数据库获取CKD疾病相关靶点,YQHG和CKD之间的交叉靶点可视为候选目标靶点。构建YQHG活性化合物-靶点、中草药-候选靶点、蛋白-蛋白相互作用网络,实现网络可视化并进行拓扑分析。通过GO功能富集和KEGG富集分析,预测YQHG治疗CKD的主要成分、关键靶点及信号通路,最后进行分子对接以验证分析的准确性。动物实验选用30只SD大鼠随机分为5组(n=6),分别为假手术组(Sham组),模型组(Model组),低剂量组(L-D YQHG组),中剂量组(M-D YQHG组),高剂量组(H-D YQHG组),适应性喂养7天后,除Sham组外其余四组大鼠均行5/6肾切除术进行CKD模型建立。按成人体重70kg计算,转换为大鼠等效剂量为2.8g/kg,模型建立后予Sham组和Model组大鼠2.8g/kg无菌水灌胃;L-D YQHG组大鼠1.4g/kg YQHG灌胃干预M-D YQHG组大鼠2.8g/kg YQHG灌胃干预H-D YQHG组大鼠5.6g/kg YQHG灌胃干预。收集大鼠血液、尿液、粪便及肾脏组织样本,对大鼠Scr、BUN和24h尿蛋白定量进行测定、肾脏组织进行组织切片并行HE和Masson染色,用16S rRNA测序技术检测粪便中肠道微生物群、ELISA法检测肾脏组织中炎症因子IL-6水平、Westernblot法检测肾脏组织中PTSG2、p53的蛋白表达。结果:1.从TCMSP数据库以及大量文献查询中筛选得到YQHG的活性化学成分63种,其中槲皮素,山奈酚,木犀草素,7-O-甲基异粘多糖醇,汉黄芩素,豆甾醇是其主要活性成分。经整理筛选后获得63个活性化合物的对应靶点250个,其中PTGS2具有最高的滤过参数且是YQHG 10味中药的共有靶点,该靶点的存在是中医协同作用的一种表现,可能参与了 CKD的病理过程。2.通过OMIM数据库、DisGeNET数据库、GeneCards数据库、Malacards数据库及TTD数据库筛选得到1 161个CKD相关靶点,汇总YQHG与CKD共有靶点,整理后得到79个交叉靶点,其中TP53,AKT1,RELA,IL6,MAPK1和ESR1可被认为是YQHG治疗CKD的候选靶点,p53被认为是最关键的信号通路。3.对药物疾病共有靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析,结合通路、靶点以及文献数据分析得出,YQHG可能通过调节细胞周期和凋亡,调节活性氧(ROS)代谢过程发挥对CKD的治疗作用。4.大鼠肾脏观察、肾功能分析显示,各治疗组以剂量依赖性方式阻碍了 CKD进展,使得大鼠体重增加、肾脏恢复红棕色、边界清晰、肾囊完整光滑。与Model组相比,YQHG以剂量依赖性方式降低了大鼠Scr,BUN和尿蛋白的值。5.组织病理学结果显示,YQHG治疗使5/6肾切除大鼠的炎症浸润,系膜扩张,肾小管萎缩和扩张,肾小球硬化和间质纤维化得到显著改善。YQHG治疗显著降低了肾小球纤维化面积,H-D YQHG治疗显著降低了肾小管间质纤维化面积。6.肠道微生物群分析结果显示:①PCoA主坐标分析显示,YQHG干预的各治疗组大鼠的肠道微生物组成更接近Sham组大鼠的肠道微生物组成,且与Model组大鼠的肠道微生物组成不同;②门水平上的群落分析显示,与Sham组和各治疗组的大鼠相比,Model组大鼠的肠道微生物组成存在部分细菌的明显改变,如厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidota)发生明显改变。7.ELISA和Western blot检测结果显示:①H-D YQHG干预显著降低了肾脏组织中PTGS2的表达;②H-D YQHG干预可在一定程度上调节p53的表达;③YQHG干预后,肾组织中IL6的表达显著降低。结论:1.YQHG能通过多成分、多途径、多靶点协同作用干预CKD的疾病进展,p53信号通路可能是其潜在的核心作用通路;2.YQHG对5/6肾切除大鼠具有显著的肾脏保护作用,其特点是减轻肾脏组织损伤,改善肾功能和减少肾纤维化;3.YQHG干预有效地恢复了肠道微生物群的组成,降低了厚壁菌门(Firmicutes)/拟杆菌门(Bacteroidota)比例,从而促进了肠道微生物环境的正常化,帮助发挥中药疗效;4.YQHG可在一定程度上调节5/6肾切除大鼠的p53信号通路,抑制PTGS2,IL6的表达,从而发挥对肾脏的保护作用。
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