生物法合成α-熊果苷的研究

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熊果苷是属于糖苷类化合物,可以通过转糖基酶催化合成,与传统工艺上的化学合成相比具有其独特的优越性。   本试验主要研究了巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium NCIB 8508蔗糖磷酸化酶的分离鉴定及其催化合成α-熊果苷的工艺条件,并与野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris pv.campestris(Xcc)8004胞内粗酶液催化合成α-熊果苷的工艺条件进行比较。   通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳初步验证了巨大芽孢杆菌NCIB 8508胞内粗酶液中存有蔗糖磷酸化酶,并研究了粗酶液的部分酶学性质。蔗糖磷酸化酶反应的最适pH为7.5,最适温度为50℃,并通过其反应速度曲线可观察到蔗糖磷酸化酶催化反应是一个可逆反应。   通过硫酸铵盐析与sephacrylTMs-300 high resolution凝胶层析对粗酶液进行分离纯化,并由SDS-PAGE电泳进行纯化鉴定,发现sephacrylTMs-300high resolution凝胶层析采集到的5号管收集液中存有一条与标准蔗糖磷酸化酶相近的蛋白带,其分子量约为56kDa。经3,5-二硝基水杨酸测还原糖含量法检测收集液与蔗糖的反应液在540nm处有吸光值,说明其有催化活性,从而证实了巨大芽孢杆菌NCIB8508胞内粗酶液存在蔗糖磷酸化酶。   研究了巨大芽孢杆菌NCIB 8508蔗糖磷酸化酶粗酶液生物催化合成α-熊果苷的工艺条件。考察了缓冲溶液pH、缓冲溶液浓度、对苯二酚浓度、反应物摩尔比及反应时间等因素对反应的影响。结果表明,在温度30℃,摇床转速180rpm,湿菌体50mg·mL-1破碎细胞粗酶液催化合成α-熊果苷中,最适反应pH为6.5,最适对苯二酚浓度为5mmol·L-1,最适对苯二酚与蔗糖的摩尔比为1:5,最适反应时间为24h,熊果苷含量达0.35mg·mL-1,对苯二酚选择性为4.0%,对苯二酚转化率为74%。   研究了野油菜黄单胞菌8004胞内粗酶液生物催化合成α-熊果苷反应的工艺条件。考察了缓冲溶液pH、对苯二酚浓度、反应物摩尔、反应时间以及菌体浓度等因素对反应的影响。结果表明,确定了最佳反应条件:在反应温度35℃,摇床转速180rpm条件下,当湿菌体50mg·mL-1破碎细胞粗酶液催化合成α-熊果苷时,最适反应pH为7.0,最适对苯二酚浓度为40mmol·L-1,最适对苯二酚与蔗糖的摩尔比为1:30,最适反应时间为36h。在此条件下,熊果苷含量达3.43mg·mL-1,对苯二酚选择性为41%,对苯二酚转化率为78%。当菌体浓度为80mg·mL-1时,其他反应条件不变下,熊果苷含量能达到6.58mg·mL-1,对苯二酚选择性为66%,对苯二酚转化率为91%。   对巨大芽孢杆菌NCIB 8508蔗糖磷酸化酶粗酶液与野油菜黄单胞菌8004胞内粗酶液催化合成α-熊果苷反应的工艺条件进行比较,得出利用野油菜黄单胞菌8004胞内粗酶液生物催化合成α-熊果苷反应更具有优势。
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