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目的：肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一,它的发病率和死亡率己跃居各种恶性肿瘤的首位,目前含铂的化疗方案己被公认为是肺癌化疗的一线方案。然而在临床上,多数患者经初次化疗后,甚至有部分患者在第一次化疗时,肺癌细胞就对顺铂产生了耐药性,影响了治疗效果,导致化疗失败。如何逆转肿瘤的多药耐药、增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,提高化疗的效果是临床上亟待解决的问题。12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)是佛波酯类化合物中活性较高的一种,是蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的高亲和力物质。TPA通过激活PKC可以产生多种生物学效应,比如刺激或抑制细胞增殖和诱导分化、激活核转录因子及细胞表面受体、肿瘤促发等。已有研究表明TPA能够促进肺癌细胞的分化而降低其恶性程度,还能增强肿瘤细胞对顺铂的敏感性,如在人宫颈癌细胞、卵巢癌细胞等,而在肺腺癌细胞尚无报道。本课题拟采用体外培养A549及其耐顺铂细胞株A549/CP为研究对象,探讨TPA能否增强肺腺癌细胞对顺铂的敏感性,并对其作用机制进一步研究,为临床肺癌的治疗寻找新的途径和方法提供实验基础。
方法：⑴细胞培养人肺腺癌细胞株A549用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基在37℃温度,5%CO2饱和湿度的无菌培养箱中进行常规培养,每天观察一次视情况传代,平均每三天传代一次。A549/CP细胞在培养基中加入2μg/ml的顺铂,其它培养条件同A549细胞。⑵TPA单用及联合顺铂对肿瘤细胞的增殖的影响采用MTT比色法检测两药单用及联合对肿瘤细胞增殖抑制的变化,绘制量效曲线,并进行统计学分析,评价TPA对顺铂抗肿瘤作用的影响。⑶TPA对肿瘤细胞内铂离子浓度的影响用无焰原子吸收法检测肿瘤细胞内铂离子浓度的变化。⑷TPA对细胞Na+,K+-ATP酶活性及其亚基表达水平的影响分别以Na+,K+-ATP酶活性检测试剂盒和Western Blotting法检测TPA对两种细胞株Na+,K+-ATP酶活性和Na+,K+-ATP酶亚基表达水平的影响。
结果：①TPA对细胞增殖的影响。TPA在1.6 nM和8.1 nM的浓度TPA对细胞增殖无抑制作用,而16.2nM及其以上浓度TPA对细胞有明显增殖抑制作用,呈剂量依赖性。②TPA增强细胞对顺铂敏感性。A549细胞,药物作用24小时CP单用组分别与1.6nM TPA联合组、8.1nMTPA联合组相比IC50分别下降62%和69%(P＜0.01,与CP组比较),增敏倍数分别为2.6、3.2;药物作用48小时CP单用组分别与1.6nM TPA联合组、8.1nMTPA联合组相比IC50分别下降67%和68%(P＜0.01,与CP组比较),增敏倍数分别为3.0、3.1;药物作用72小时CP单用组分别与1.6nM TPA联合组、8.1nMTPA联合组相比IC50分别下降55%和63%(P＜0.01,与CP组比较),增敏倍数分别为2.2、2.7;药物作用96小时CP单用组分别与1.6nM TPA联合组、8.1nMTPA联合组相比IC50分别下降74%和77%(P＜0.01,与CP组比较),增敏倍数分别为3.8、4.4。A549/CP细胞,药物作用24小时和48小时CP单用组分别与1.6nM TPA联合组、8.1nM TPA联合组相比IC50值统计无显著差异;药物作用72小时CP单用组分别与1.6nM TPA联合组、8.1nM TPA联合组相比IC50分别下降23%和17%(P＜0.05,与CP组比较),增敏倍数分别为1.3、1.2;药物作用96小时CP单用组分别与1.6nM TPA联合组、8.1nM TPA联合组相比IC50分别下降67%和69%(P＜0.01,与CP组比较),增敏倍数分别为3.0、3.2。③TPA对顺铂在胞内蓄积的影响。A549胞内铂离子浓度随着顺铂剂量的增加而增加呈剂量依赖性,1.6nM、8.1nM TPA处理组在10gg/ml、20μg/ml、30μg/ml顺铂作用两小时后其胞内铂离子浓度均增加一倍以上,显著高于CP组(P＜0.01);TPA+哇巴因组分别同TPA各处理组相比胞内铂离子浓度下降75%以上(P＜0.01)。A549/CP胞内铂离子浓度随着顺铂剂量的增加而增加呈剂量依赖性,1.6nM、8.1nM TPA处理组在10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml顺铂作用两小时后其胞内铂离子浓度均增加一倍以上,显著高于CP组(P＜0.01);TPA+哇巴因组分别同TPA各处理组相比胞内铂离子浓度下降77%以上(P＜0.01)。④TPA对顺铂从细胞内流出的影响。A549、A549/CP细胞株与含30μg/ml顺铂的培养基中培养2小时后,立即更换为新鲜无顺铂培养基。分别考察30min、60min、120min后TPA处理组与对照组中胞内所剩余的铂离子浓度百分比进行比较,TPA处理组与正常对照组细胞胞内铂离子含量无统计学差异。⑤TPA对Na+,K+-ATP酶活性的影响。A549/CP细胞Na+,K+-ATP酶活性显著低于A549细胞(P＜0.05),TPA能够显著增强A549、A549/CP细胞的Na+,K+-ATP酶活性(P＜0.05,与control组相比),并呈剂量依赖性。⑥TPA对Na+,K+-ATP酶α1、β1表达水平的影响。TPA处理组与正常组相比A549、A549/CP细胞Na+,K+-ATP酶β1的表达均增加一倍以上(P＜0.01),Na+,K+-ATP酶α1表达变化并不显著。
结论：⑴TPA能够显著增加肺腺癌细胞对顺铂的敏感性。⑵TPA增敏顺铂的机制可能与其提高Na+,K+-ATP酶活性,增加顺铂在胞内的浓度有关。