椎间盘退变、突出的发病率相当高，这一点已是不争的事实。最新的椎间盘生理、生化及病理研究证明：椎间盘的含水量的保持主要依赖其基质中蛋白多糖的含量，Ⅱ型胶原则在椎间盘承受压力方面发挥关键作用。内因、外因及遗传方面的诸多因素导致椎间盘逐步退变后，其实质就是基质中蛋白多糖的减少，含水量降低，Ⅰ型胶原出现在基质中，Ⅰ、Ⅱ型胶原的比例明显上升，髓核呈纤维样改变，导致椎间盘的膨胀压降低，承重能力下降，椎间高度降低，椎间盘承受的重力不能平均地向各方向传递，致使纤维环疲劳、破裂、髓核突出，造成脊髓或马尾神经受压，引起严重后果。 针对椎间盘退变、突出，传统的治疗方法有两大类：一是非手术疗法；二是手术切除病灶。非手术疗法是以缓解症状为主，依靠的是患者的自我调节和修复能力，而椎间盘是一个血供十分差的组织，尤其是在髓核内，根本就没有血液供应，其营养及氧的获得主要靠被动扩散，细胞活力相当差，所以，椎间盘的自我修复能力十分有限，这就是经非手术疗法缓解的病人，常常复发的原因，其中部分病人不得不转而行手术治疗。手术疗法虽然能解除脊髓的致压物，但是，它一方面增加了病人的痛苦，另一方面又以牺牲病人脊柱的生理完整性为代价。 是否有一种方法既能从根本上阻止甚至逆转椎间盘的退变进程又能保持脊柱的生理完整性，同时将病人所承受的痛苦减到最低呢? 在体外实验中，转化生长因子β₁（TGF-β₁）能促进髓核细胞产生蛋白多糖，同时能对Ⅱ型胶原起调节作用。在此基础上我们进行了一些探索性的研究。我们通过PCR从pcDNA3.1（+）-TGFβ₁质粒中大量扩增了TGF-β₁基因片段。运用同源重组的方法构建了携带人TGF-β₁基因的重组腺病毒载体（Ad／CMV-h TGFβ₁）尝试性地培养了兔腰椎间盘髓核细胞，同时观察细胞的演变，探讨髓核细胞的生物学行为及影响因素，并用脂质体将绿色荧光蛋白（EGFP）基因导入兔髓核细胞内，观察基因的表达情况。结果为：原代细胞生物学性状最接近体内细胞，传代后细胞呈现衰老现象。活力测定提示，随着培养时间的延长及传代，细胞活力逐渐降低。髓核细胞内细胞器的变化与其生物学活性变化相一致。在用脂质体将绿色荧光蛋白基因导入髓核细胞后，细胞在24小时后即可发出绿色荧光，并能持续发光3个月，直至细胞死亡。兔髓核细胞培养的成功，建立了体外髓核细胞培养的模型，绿色荧光蛋白在髓核细胞内的成功表达，说明髓核细胞适合表达外源性的基因，为将治疗性基因导入髓核细胞从而产生治疗效果的后续实验奠定了基础。 在兔髓核细胞培养成功的基础上，我们又进行了人退变椎间盘髓核细胞的原代 第二军医大学博士学位论文 培养，并获得了成功，希望以体外原代培养的细胞模拟在体内的退变情形。另外， 我们将Ad／Cy十TGF p；转染至人退变的髓核细胞中，用免疫组化染色观察TGF－p ；的表达及其对髓核细胞＊型胶原合成的调控作用。结果表明：TGF－P；在髓核细 胞内得到了大量的表达，实验组TGF－i；免疫组化结果呈强阳性，而对照组只显示 弱阳性。11型胶原免疫组化染色结果显示：实验组染色为强阳性，而对照组只显示 了很弱的阳性，说明人退变髓核细胞不仅能大量表达外源性的TGF－p；编码基因， 还能在基因产物的作用下增加11型胶原合成的能力。 在体研究中，我们将＊／CMV－hTGF i；，生理盐水及＊／CM’M－LaCZ分别注入兔椎 间盘髓核组织中，于注射后 10天、20天用免疫组化定性检测 TGF－p；的表达，于 注射后10天、20天、45天分别用ELISA定量检测TGF寸；在髓核组织中的含量， 称取髓核组织的重量及用放免法检测透明质酸的变化情况。结果显示：注射了 Ad／CM’e－hTGF i；的髓核组织，不管是 10天组还是 20天组，都显示了广泛而强烈的 免疫组化阳性染色结果，而注射生理盐水或Ad／CMV－LacZ的髓核组织仅显示了很弱 的阳性染色。TGF－pl的ELISA定量检测结果显示：Ad／CWi－hTGFpl组中10天。 20天、45天组的TGF一p；产量分别是对照组的3倍、2．6倍及2倍（P＜0．01）。注 射了Ad／CM’M－hTGF pl的髓核组织的重量分别为对照组的1．8倍、2．3倍及2倍0 wto．01)。实验组各天数之间及对照组之间均无统计学差异。放免法定量结果显示： 实验组髓核组织中透明质酸的含量大大增加。实验组10天、20天、45天的透明质 酸含量，分别为对照组的互．5倍、1．7倍及1．6倍（P＜0．01）。实验组各天数之间 也有统计学差异，而对照组之间无显著差异。 卜 在 TGF－6；基因调节＊型胶原含量的在体研究中，我们将 Ad／CMV－hTGF p；和 生理盐水分别注入兔椎间盘髓核组织中，于注射后 10?