背景:非酒精性脂肪肝病（NAFLD）是目前最常见的肝脏疾病,是其它慢性肝病的形成主要原因,NAFLD进一步发展会导致非酒精性脂肪肝炎（NASH）、肝硬化和肝细胞癌的发生。在世界范围内,NAFLD患病率约为25%,其中南美洲（31%）和中东（32%）发病率最高,其次是亚洲（27%）,美国（24%）和欧洲（23%）;而NAFLD在非洲比较少见（14%）。该病是一种与肥胖、糖尿病密切相关的慢性肝脏疾病,在中国的发病率高达15-20%,对国民经济发展造成沉重负担。目前尚无用于治疗NAFLD的药物,因此深入研究NAFLD发病机制,开发相关药物成为了一个重要的课题。蛋白激酶G（PKG）是丝氨酸/酪氨酸特异性激酶,是cGMP信号的主要作用因子。在转录水平上,一系列因子被发现对PKG1的表达具有调控作用,如Sp1/Sp3,KLF4,p53,FoxO1,USF1/2和RhoA等,它们大多与NO/环核苷酸途经相关。我们以前的研究证实,过表达蛋白激酶G-1（PKG-1）能调节高脂饲料诱导的肥胖小鼠的脂质代谢,降低脂质在小鼠体内的储积,而肥胖常常伴随着NAFLD的发生,但是PKG-1对NAFLD的作用机制尚不明确,因此本研究应用小鼠单纯肥胖并发晚期糖尿病动物模型,通过生物化学与分子生物学的技术手段对PKG1基因调控非酒精性脂肪肝的效应及分子机理进行研究,为研究开发与PKG1相关的治疗NAFLD的药物提供实验支持。目的:探索PKG-1对非酒精性脂肪肝的作用及其作用机制。方法:1.小鼠脂肪肝模型的建立及实验分组实验小鼠分为四组:ob^-/-CD⁺组、ob^+/-CD⁺组、ob^-/-CD^-组和ob^-/-CD^-组。ob^-/-组小鼠为obese基因隐形纯合小鼠,该小鼠食物摄入量大,易肥胖,是常作II型糖尿病研究的动物模型。ob^+/-小鼠为ob^-/-小鼠与野生型小鼠杂交繁育而成。CD⁺组小鼠为PKG-1基因过表达的小鼠,为美国肯塔基大学营养学院王淑霞教授实验室原有小鼠,通过CD⁺小鼠与ob^-/-小鼠杂交获得,经过基因型鉴定后分为ob^-/-CD⁺、ob^+/-CD⁺、ob^-/-CD^-和ob^+/-CD^-四组小鼠,选择每组6只雌性小鼠进行实验。2.小鼠肝脏称重及肝脏指数的计算在小鼠20周龄时称取小鼠的体重,解剖小鼠并称取肝脏的湿重,用小鼠的肝脏重量除以小鼠体重得出肝脏指数。3.小鼠肝脏组织形态学观察小鼠肝脏组织用10%的福尔马林固定后,石蜡包埋,在制成石蜡切片后进行HE染色,显微镜下观察肝脏组织的结构;肝脏组织的纤维化程度是通过masson染色和Sirius red染色后,显微镜下观察胶原纤维的分布来确定的。4.小鼠肥胖及纤维化相关基因转录水平检测采用qPCR方法检测与脂肪合成降解相关基因,如CPT1A、PGC1α、PPAR GAMA、SREBP和FASN,及纤维化相关基因,如CollagenI/III/IV、TGF-b、Fibronectin的转录水平。结果:1.PKG-1过表达可以明显改善小鼠脂肪肝程度。在ob^-/-纯合肥胖模型中,过表达PKG-1小鼠与非过表达PKG-1小鼠相比,体重与肝指数均显著降低,TG与蛋白总含量比值也显著降低。HE染色表明,过表达PKG-1小鼠与非过表达PKG-1小鼠相比,脂肪空泡明显减少,且肝脏组织结构较为完整。以上结果表明,PKG-1过表达可以显著改善肥胖模型小鼠的脂肪肝程度。2.PKG-1过表达下调脂肪降解、脂肪合成及游离脂肪酸吸收的相关基因表达。在肥胖模型中,过表达PKG-1小鼠与非过表达PKG-1小鼠相比,脂肪氧化分解的相关基因CPT1a与PGC1α,脂肪合成的相关基因PPAR GAMA、SREBP和FASN,游离脂肪酸吸收的相关基因CD36、FATP2和FATP5,均显著下调。说明PKG-1过表达调控下游脂肪降解、合成及游离脂肪酸吸收的转换过程。3.PKG-1过表达减弱了肝脏细胞中的炎症反应。在肥胖模型中,过表达PKG-1小鼠与非过表达PKG-1小鼠相比,炎症因子IL-6和TNF-α均显著下调。过表达PKG-1引起炎症反应减弱可能与脂肪减少相关。4.PKG-1过表达能够显著抑制肝脏组织纤维化。在肥胖模型小鼠中,与非过表达PKG-1小鼠相比,过表达PKG-1小鼠肝脏组织中的胶原染色较弱。另外肝细胞纤维化相关基因CollagenI/III/IV和Fibronectin,与非过表达PKG-1小鼠比,PKG-1过表达组小鼠肝脏中的上述基因表达水平显著降低。以上结果表明,PKG-1过表达显著抑制肝脏组织的纤维化。结论:1.在obese基因缺失组小鼠中,PKG-1过表达显著降低非酒精性脂肪肝的脂肪积累水平。2.过表达PKG-1可以改善肝脏纤维化的程度。3.过表达PKG-1可能通过降低肝脏炎症反应来保护非酒精性脂肪肝。