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背景糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)最常见的微血管并发症,近30年来我国DM发病率持续激增为DKD提供了庞大基数,DKD已成为引起慢性肾脏疾病(chronic kidney disease,CKD)的主要病因。DKD发病机制较复杂,TGF-β1在多种病理刺激下上调,通过TGF-β1/Smad信号传导诱导细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积,加速肾脏纤维化进程。越来越多的研究表明干预TGF-β1/Smad通路对DKD有治疗作用。目前西医主要通过治疗原发病以延缓病程,中医不仅改善临床症状,还可减少蛋白尿、延缓肾脏病理损伤,开展中医药早期干预DKD的研究刻不容缓。导师提出治疗关键在于早中期抓住机会直击核心病机“消渴热”,对延缓病程、改善预后意义重大。本研究在前期研究基础上,假设消渴肾方对早中期DKD db/db小鼠模型的肾脏保护作用是通过在早期抑制促进肾脏纤维化的TGF-β1/Smad信号通路传导而实现的。拟通过动物实验以消渴肾方干预早中期DKD db/db小鼠模型,观察小鼠体重、血糖、尿蛋白、肝肾功能、血脂、光镜及电镜下肾脏组织结构及TGF-β1/Smad通路相关蛋白的影响,为临床使用消渴肾方治疗DKD提供理论依据。目的通过动物实验,观察消渴肾方对早中期DKD db/db小鼠的血糖、尿蛋白、肾脏病理、TGF-β1/Smad通路相关蛋白的影响,探讨其取效机制,为临床治疗DKD提供理论依据。方法1、选用雄性8周龄SPF级C57BL/KSJ系db/db小鼠50只;同遗传背景的雄性8周龄SPF级db/m小鼠10只。适应性饲养4周后将db/db小鼠随机分为模型组(db/db组)、西药组(db/db+A组)、消渴肾方低剂量组(db/db+L组)、消渴肾方中剂量组(db/db+M组)、消渴肾方高剂量组(db/db+H组)共5组,每组10只,同时设10只db/m小鼠为正常对照组(db/m组)。2、连续12周分组灌胃给药。db/db+A组予氯沙坦钾细末45.5 mg/kg/d,db/db+L组、db/db+M 组、db/db+H 组分别予消渴肾方颗粒 1.06g/kg/d、2.12 g/kg/d、4.24g/kg/d,db/m组及db/db组均予生理盐水灌胃。3、观察小鼠一般情况,定期检测随机血糖、24h尿微量白蛋白(microalbuminuria,mALB)。12周后留取小鼠血液及肾脏标本,检测血生化指标,分别在光镜、透射电镜下观察肾脏病理形态学改变,Western blot法检测各组小鼠肾组织TGF-β1/Smad通路相关蛋白(TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad7)和 E-cadherin、α-SMA 蛋白的表达。4、用SPSS 22.0进行数据统计分析,结果以p<0.05代表差异具有统计学意义。结果1、一般情况和体重消渴肾方能不同程度地改善小鼠精神、形体、毛发、反应、饮食、二便等异常状态。各组db/db小鼠较db/m组显著肥胖(p<0.01),用药后各组小鼠体重呈小幅度波动。2、随机血糖db/m组随机血糖始终在低水平稳定波动,各组db/db小鼠较db/m组始终处于高水平状态。与db/db组相比,db/db+M组从第4周起明显降低(p<0.05),第8、12周持续呈显著降低(p<0.01);db/db+L组于第8周起显著降低(p<0.01)。与db/db+A组相比,第8周时db/db+M组显著降低(p<0.01),第12周时db/db+L、db/db+M组显著降低(p<0.01)。直至实验结束各组db/db小鼠随机血糖尚未降至正常水平。随时间延长各组db/db小鼠血糖走势不同。各组db/db小鼠随机血糖于0周时趋于一致,0-4周出现不同程度的上升,4-8周db/db及db/db+A组继续升高,消渴肾方各组呈不同程度下降趋势,8-12周消渴肾方各组均低于同期db/db组和db/db+A组,db/db+M组的下降最明显。db/db、db/db+A组持续上升,db/db+L、db/db+M组先升后降。3、24h尿微量白蛋白与db/m组相比,治疗前后各组db/db小鼠24h-mALB均升高(p<0.05,p<0.01)。与db/db组比较,治疗后db/db+A、db/db+L、db/db+M组均显著下降(p<0.01),其中db/db+L 组、db/db+M 组较 db/db+A 组下降更明显(p<0.05,p<0.01)。4、生化指标各组小鼠CRE、BUN、TG的水平差异无统计学意义(p>0.05)。与db/m组相比,db/db组小鼠ALT、ALB水平显著升高(p<0.01),AST的变化无统计学意义(p>0.05),db/db+A组和db/db+L组的TC水平显著升高(p<0.01)。与db/db组和db/db+A组相比,db/db+M组AST明显降低(p<0.01),db/db+L组、db/db+M组的ALB显著升高(p<0.01);与db/db组相比,各治疗组ALT、TC水平差异无统计学意义(p>0.05)。5、肾脏病理形态学观察光镜观察:与db/m组相比,db/db组肾小球结构紊乱,毛细血管袢肥大,基底膜增厚迂曲,系膜基质增生,肾小囊窄缩,肾小管上皮细胞空泡样变性,可见较多糖原沉积及胶原纤维增生。db/db+A、db/db+L、db/db+M组上述病理变化均有不同程度的改善。电镜观察:与db/m组相比,db/db组基底膜呈弥漫性均质性增厚,三层结构模糊,足突广泛融合,足细胞下间隙、窗孔结构消失,系膜细胞增生,系膜基质增多呈团块状。db/db+A、db/db+L、db/db+M组上述病理变化均有不同程度的改善。6、TGF-β1/Smad通路相关蛋白的表达与db/m组相比,db/db组TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3的表达均升高,其中TGF-β1、p-Smad2显著升高(p<0.01)。与db/db组相比,不同剂量消渴肾方组治疗后的TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3表达有不同程度降低,其中db/db+M和db/db+H组p-Smad2的表达明显降低(p<0.05),且较db/db+A组降低更明显(p<0.05)。各组Smad7的表达无统计学差异(p>0.05)。7、E-cadherin 和 α-SMA 的表达db/db组较db/m组E-cadherin表达降低、α-SMA表达升高(p<0.01)。与db/db组相比,消渴肾方各组的E-cadherin表达不同程度地升高,其中db/db+H组显著升高(p<0.01),较db/db+A组更明显(p<0.05)。同时消渴肾方各组α-SMA表达不同程度地降低,其中 db/db+L 组、db/db+H 组降低明显(p<0.05,p<0.01)。结论通过动物实验,发现消渴肾方能在保证安全性的前提下有效降低早中期DKD db/db小鼠的随机血糖、24h-mALB,明显改善小鼠肾脏病理损伤并修复肾脏超微结构,其肾脏保护作用可能与早期抑制TGF-β1/Smad通路介导的肾脏纤维化相关。中剂量的消渴肾方总体疗效较低、高剂量的消渴肾方更为突出。