背景与目的大肠癌（Colorectal adenocarcinoma,CRC）发病率和死亡率居全球恶性肿瘤第三位和第四位。在发达国家发病率居恶性肿瘤第二位,为5%。当病变还局限在肠壁时外科手术是治疗的基础,70%-80%的病人通过病灶的切除得以治愈。外科治疗后,病灶局限的病人5年生存率为90%,而假如有了淋巴结转移5年生存率则减为65%,因此对大肠癌的早期检测是提高生存率最有效的办法。现在多认为大肠癌由正常粘膜转化为癌前病变腺瘤然后成为大肠癌是由一系列基因改变而引起。在肿瘤研究中,生物标志物可提示体内癌症的存在。大多数生物标志物基于基因突变或RNA、蛋白和代谢产物的异常改变,因此可用于检测早期大肠癌,以及预测疾病预后、监控疾病过程和对治疗的反应。近年发现了一个新的膜蛋白Claudins家族。Claudins属于四分子交联体,为紧密连接蛋白,至少包括了24个家庭成员,位于腺上皮和内皮细胞膜靠腔面的一端,是相邻细胞膜之间最顶端的接触,对上皮细胞的屏障功能起着重要作用。它们编码4个跨膜区,N和C羧基末端均在细胞浆内。在正常上皮,紧密连接的主要功能是封闭腺上皮顶端的间隙,形成一个能阻止大分子物质通过细胞膜之间的间隙进入基底外侧区域的屏障。紧密连接是主导细胞粘附、细胞极性和腺体分化的关键因素之一。由于它可作为胞外环境到胞内信号通道的结合点,因此在细胞增生、肿瘤形成、细胞骨架等方面扮演了重要角色,越来越多的研究表明,这个家族许多成员对恶性肿瘤转移有着重要影响。Claudins家族中不同成员在不同器官癌症的作用并不是非常清楚。肿瘤细胞特别是那些高转移潜能的癌细胞通常表现为Claudins表达下降,但亦有报道某些Claudins成员在一些肿瘤中是增加的,如Claudin-1（CLD1）在大肠癌是增加的。有报导CLD1可以促进癌细胞pro-MMP-2的活性,这表明它是癌细胞侵袭转移潜在因素。还有报导CLD1可能是β-catenin/Tcf信号通路的靶基因,这支持CLD1可能是调控结肠癌潜在基因。综上所述,我们推测CLD1参与了大肠癌细胞侵袭转移过程,是大肠癌细胞侵袭转移的潜在因素。大肠癌的组织分期是一个重要预后指标,由于目前国际上尚无按组织分期对CLD1进行系统研究的报道,此范围的研究仍属空白,因此我们应用免疫组织化学方法检测大肠正常-腺瘤-癌（不同Dukes分期）组织中CLD1的表达,以利于明确其与大肠癌变病程的关系。然后我们选取三株已证实具在不同转移潜能的大肠癌细胞株SW620,SW480和SW1116为研究对象,通过激光共聚焦显微镜、实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（FQ RT-PCR）和Western Blot检测CLD1在这三株细胞的表达,随后进行CLD1基因转染和RNA干扰,对基因进行调控,观测调控前后大肠癌细胞在体外和动物体内侵袭转移生物学行为变化,初步探研CLD1影响大肠癌侵袭转移行为的机制。由于CLD1是膜蛋白,位于细胞表面,研究CLD1表达与调控将有助于阐明肿瘤细胞的侵袭转移机制,并可能为大肠癌的诊治带来新的研究靶点。材料与方法1.免疫组织化学检测大肠组织的CLDI表达为能直观系统地观察CLD1在大肠癌病程演进中的作用,我们进行了CLD1在大肠组织中表达分布差异分析。免疫组织化学检测87例原发癌以及配对癌旁正常大肠粘膜、15例大肠息肉（非肿瘤性息肉）、16例腺瘤（肿瘤性息肉）CLD1的表达,观察CLD1在细胞表达部位和强度的差异。2.细胞的选取前期实验已证实转移潜能SW1116＜SW480＜SW620,我们选取此三株大肠癌细胞株为研究对象。运用免疫细胞化学、激光共聚焦显微镜检验CLD1在细胞中的表达部位,FQ RT-PCR和Western Blot从mRNA和蛋白两个表达水平检测CLD1表达量的差异。选取SW480细胞（低表达CLD1）和SW620细胞（高表达CLD1）分别进行基因转染和RNA干扰（RNA interference,RNAi）实验。之所以选这两株细胞是因为他们是从同一病人的原发灶和转移灶衍生出来的细胞株,用于研究将更有意义。3.转染CLD1基因对SW480细胞侵袭转移的影响首先构建CLD1表达载体CLD1/pEGFP-C1,然后采用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000^TM脂质体分别将pEGFP-C1空质粒和CLD1/pEGFP-C1转染进入细胞,用G418筛选阳性细胞克隆并扩增培养。FQ RT-PCR检测CLD1表达水平改变,激光共聚焦显微镜检测转染蛋白的定位。细胞同质粘附实验测定相同细胞之间的粘附性,细胞异质粘附实验测定细胞与Ⅳ型胶原的粘附性,细胞侵袭实验测定细胞的侵袭能力,细胞划痕实验检测细胞的迁移能力。4.RNAi对SW620细胞侵袭转移的影响利用RNA干扰（RNAi）技术沉默高表达CLD1的SW620细胞株表达量,经FQ RT-PCR、Western Blot、激光共聚焦显微镜检验CLD1的干扰效果。体外进行细胞同质粘附、异质粘附、侵袭实验、迁移实验了解细胞侵袭转移能力的变化。动物体内实验对无胸腺小鼠进行了异种种植肿瘤细胞实验,包括裸鼠背侧皮下移植瘤细胞实验（局部肿瘤形成模型）、裸鼠爪垫皮下移植瘤细胞转移实验（淋巴转移模型）、裸鼠脾内移植瘤细胞转移实验（血液转移模型）。5.统计学分析采用SPSS13.0统计软件,P＜0.05差异具显著性。结果1.免疫组织化学检测大肠正常粘膜、息肉、腺瘤和大肠癌组织CLD1的表达（1）CLD1在组织中的表达部位结果表明CLDl主要表达于肠上皮细胞,而在细胞外基质基本不表达。（2）CLD1在细胞膜表达比较经Kruskal-Wallis Test检验χ²=2.469,P=-0.872,正常粘膜、息肉、腺瘤和大肠癌A-B-C-D期CLD1膜表达无显著差别。（3）CLD1在大肠正常粘膜-息肉-腺瘤-大肠癌细胞浆之间比较经Kruskal-Wallis Test检验χ²=106.83,P=0.000,细胞浆CLD1的表达有显著差别。正常粘膜和息肉主要局限在细胞膜表达,分别有3.4%和20%弱阳性浆表达,无中等和强阳性。而腺瘤62.5%出现了浆表达,12.6%为中等和强阳性;大肠癌84.6%浆表达,中等和强阳性比例高达43.7%。（4）CLD1在正常粘膜-息肉-腺瘤-大肠癌A-B-C-D期之间浆表达的比较经Kruskal-Wallis Test检验（χ²=95.71,P=0.000）,有显著性差异。最有意义的是,A期浆表达发生率最高（87.5%）,中等阳性与强阳性之和也是最高（56.3%）,说明CLD1从膜表达到浆表达变化最显著时期在癌变早期A期。（5）CLD1在大肠细胞核表达仅发现4例核表达,分别发现于腺瘤、大肠癌A、B、C期。经Kruskal-Wallis Test检验χ²=4.46,P=0.108,无显著差别。（6）正常粘膜-息肉-腺瘤-大肠癌CLD1总阳性表达的比较经Kruskal-Wallis Test检验（χ²=23.42,P=0.000）,有显著性差异,CLD1的总表达量逐渐增强。正常粘膜与息肉CLD1表达量较少,腺瘤和大肠癌表达总强阳性率（+3以上）逐渐增加。（7）正常粘膜-息肉-腺瘤-大肠癌A-B-C-D期CLDI总阳性的比较经Kruskal-Wallis Test检验（χ²=42.52,P=0.000）,有显著性差异。腺瘤、大肠癌A期阳性表达率高达100%,而A期强阳性表达率（62.4%）显著高于腺瘤（37.5%）。说明CLD1的总表达量改变可以提示早期大肠癌发生,即从腺瘤开始显著增高,A期逐渐增强至强阳性。（8）CLD1的表达与细胞分化的关系CLD1总阳性率与细胞分化无关（P=0.08）。2.大肠癌细胞株SW1116,SW480和SW620的CLD1表达差异（1）免疫细胞化学和激光共聚焦显微镜检测CLD1在细胞的分布部位SW1116为细胞膜、浆表达;SW480以细胞浆表达为主;SW620细胞以细胞核、浆表达为主。说明CLD1表达部位随着大肠癌细胞转移潜能增强,由细胞膜异位至细胞浆和核。（2）FQ RT-PCR检测CLD1 mRNA的表达水平SW1116的Ct差值最大,SW480居中,SW620的Ct差值最小,说明mRNA表达量为SW116＜SW480＜SW620。（3）Western Blot检测CLD1蛋白表达水平Western Blot显示CLD1的蛋白表达水平SW1116最低,SW480次之,SW620最高,三个细胞株的灰度值比值从低到高依次为SW116＜SW480＜SW620。3.转染CLD1基因对大肠癌细胞侵袭转移行为的影响（1）质粒的构建成功构建了CLD1带绿色荧光蛋白的真核表达重组质粒CLD1/pEGFP-C1。（2）细胞克隆建立CLD1/PEGFP-C1和pEGFP-C1成功转染SW480细胞,建立稳定的SW480^CLD1和SW480^control细胞克隆。（3）CLD1表达量的检测FQ RT-PCR检测CLD1 mRNA的表达量提示SW480^CLD1细胞CLD1表达量比SW480、SW480^control增高。（4）激光共聚焦显微镜显示转染质粒的定位激光共聚焦显微镜显示CLD1重组质粒转染在SW480细胞膜和细胞浆。（5）细胞同质粘附实验的结果在单层细胞培养时,SW480^CLD1细胞形态学表现为伸展、呈纺锤形,不利于细胞之间的粘附,而SW480^control细胞与SW480细胞相似,为圆形或类圆形,细胞之间容易粘附。同质粘附实验SW480^CLD1细胞粘附细胞数量少于SW480^control和SW480细胞（P=0.000）,粘附性强弱顺序为SW480^CLD1＜SW480^conntrol、SW480。说明提高CLD1表达后可减少SW480细胞之间的同质粘附,使肿瘤细胞脱离原发灶,便于进一步侵袭。同质粘附的的下降可使紧密连接渗透性改变,导致更多的营养物质和生长因子供肿瘤生长。（6）异质粘附实验的结果SW480^CLDI粘附细胞数多于SW480^contro（P=0.000）和SW480（P=0.000）,有显著区别。SW480^control和SW480粘附细胞数无显著区别。粘附细胞数顺序为SW480^CLD1＞SW480^control、SW480。表明提高CLD1表达后SW480细胞与Ⅳ型胶原粘附性增加。（7）细胞侵袭实验的结果SW480^CLD1穿孔细胞数显著多于SW480^control和SW480（P=-0.000）,SW480^control和SW480之间没有区别（P=-0.408）。SW480细胞的侵袭能力增强,强弱顺序为SW480^CLD1＞SW480^control、SW480。（8）细胞迁移实验的结果单层划痕试验结果显示划痕并培养48小时后,SW480^CLD1细胞迁入划痕区比SW480和SW480^cntrol多,说明SW480^CLD1迁移能力增强。4.RNAi沉默CLD1表达水平对SW620细胞侵袭转移行为影响的结果（1）构建siRNA表达载体并转染SW620成功构建了发夹样CLD1真核表达载体和无关基因重组质粒。重组质粒转染SW620细胞,通过G418抗性筛选,建立稳定的SW620^siRNA和SW620^control细胞克隆。FQ RT-PCR和Western Blot从mRNA和蛋白质水平证实SW620^siRNA细胞CLD1表达比SW620、SW620^control低。激光共聚焦显微镜检测干扰后SW620^siRNA的CLD1表达仍为细胞核为主,强度明显弱于SW620和SW620^control。以上证明SW620的CLD1干扰成功。（2）细胞同质粘附实验的结果SW620^siRNA细胞在单层细胞培养时表现较为伸展,倾向于多细胞聚集。SW620和SW620^control细胞表现为圆形或类圆形,较为松散。SW620^siRNA细胞的同质粘附细胞数量多于SW620^control（P=0.000）和SW620细胞（P=-0.000）。SW620^control和SW620细胞之间没有显著性区别。同质粘附细胞数为SW620^siRNA＞SW620^control、SW620。（3）异质粘附实验的结果SW620^siRNA粘附细胞数少于SW620^control（P=0.000）和SW620（P=0.000）,SW620^control和SW620之间差异无显著区别（P=0.269）。粘附性强弱顺序为SW620^siRNA＜SW620^control、SW620。表明降低CLD1表达后SW620细胞与Ⅳ型胶原粘附数减少。（4）侵袭实验的结果降低CLD1表达后,SW620^siRNA细胞的穿孔细胞数显著少于SW620^control（P=0.000）和SW620（P=0.000）。SW620^control和SW620之间没有显著性区别。侵袭实验强弱顺序为SW620^siRNA＜SW620^control、SW620。（5）细胞迁移实验的结果单层细胞划痕后48小时观察细胞迁移情况,显示SW620^siRNA迁移到划痕区的细胞数少于SW620^control和SW620。（6）裸鼠背侧皮下移植瘤细胞实验结果SW620和SW620^control组2周内全部成瘤,SW620^siRNA组2周内无1只成瘤,2周后方陆续成瘤。8周将裸鼠处死解剖时,全部裸鼠均成瘤。三组瘤体大小差异比较,SW620^siRNA＜SW620、SW620^control,有显著性差异（P=0.000）。病理学HE染色提示均为低分化腺癌。（7）裸鼠爪垫皮下移植瘤细胞转移实验的结果SW620和SW620^control组3-4周爪垫皮下全部成瘤,SW620^siRNA组4周内无1只成瘤,4周后方陆续成瘤。8周将裸鼠处死解剖时,全部裸鼠爪垫均成瘤。淋巴结转移情况,SW620、SW620^control组75%（3/4）发现淋巴结转移,淋巴结平均数分别为2.25个/只和2个/只,而SW620^siRNA未发现淋巴结转移。病理学HE染色提示为低分化腺癌。（8）裸鼠脾内移植瘤细胞转移实验的结果8周处死时,SW620^control和SW620组裸鼠均有肝转移现象（4/4,100%）,SW620^siRNA仅有一只发现肝转移灶（1/4,25%）。SW620、SW620^control和SW620^siRNA肝脏表面肿瘤转移灶的平均数分别为3.75个/只、3.50个/只、0.25个/只。病理学HE染色提示为低分化腺癌。结论1.免疫组织化学方法检测CLD1在大肠组织中的表达,CLD1主要位于肠上皮细胞,而在细胞外基质基本不表达。大部分正常粘膜与息肉局限在细胞膜表达,少有浆表达,且仅为弱阳性。腺瘤浆表达百分比增多、强度增加,大肠癌A期增强最显著。从腺瘤开始总阳性表达百分比显著增高,A期强阳性最多。说明CLD1表达改变可能提示早期大肠癌发生。2.运用免疫细胞化学和激光共聚焦显微镜检测三株不同转移潜能的大肠癌细胞株SW1116、SW480和SW620在CLD1表达部位,发现CLD1在细胞中的表达部位随着大肠癌的转移潜能增强由细胞膜转移至细胞浆和细胞核。FQ RT-PCR从mRNA水平、免疫蛋白印记从蛋白表达水平检测显示CLD1表达在SW1116,SW480,SW620细胞株之间存在差异,SW1116＜SW480＜SW620。3.构建的CLD1真核表达载体可有效提高CLD1表达,CLD1提高后可减少SW480细胞之间的同质粘附,利于肿瘤细胞脱离原发灶向外侵袭;增加细胞与基质的粘附力;增加细胞的侵袭能力:增加细胞的迁移能力。4.构建的CLD1发夹siRNA真核表达载体可有效抑制SW620 CLD1的表达量,在体外增加细胞之间粘附,抑制与基底膜的粘附,降低细胞的侵袭能力和迁移能力。动物实验说明降低CLD1表达可降低裸鼠成瘤能力,降低淋巴结转移和血行转移能力,说明CLD1正向调控大肠癌细胞的侵袭转移能力。5.CLD1可能在大肠癌的发生、发展过程中起着重要的作用,有望成为大肠癌病人诊断和治疗新的靶点。