论文部分内容阅读
背景食管癌（Esophageal cancer, EC）是世界上八大恶性肿瘤之一，在发达国家和发展中国家均表现出高发病率和高死亡率两大特征，其发病率呈明显的地区性分布差异。食管癌的发生发展经历多阶段缓慢演进过程，由食管鳞状上皮不典型增生到癌变一般需要几年甚至十几年的时间，这就为EC患者的早期诊断和治愈提供了机会。然而，EC患者早期症状并不明显，而且目前尚未发现高特异性、高敏感性的适于EC早期诊断的特异性生物标志物。因此，大多数EC患者在确诊时已经发展至中晚期，导致EC患者预后差、长期生存率低及死亡率居高不下。目前，EC的治疗方法包括手术治疗、放疗、化疗和生物治疗等多种综合治疗手段。尽管如此，中晚期EC患者术后长期生存并没有明显改变，亟需探寻新的治疗手段。巨噬细胞移动抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor, MIF）最初发现于活化的淋巴细胞，其后的研究发现巨噬细胞也能合成并分泌MIF，但其主要的组织学来源是垂体。MIF是一种广泛表达的细胞因子，其生物学功能多样，包括先天性与获得性免疫反应中的促炎作用、抑制糖皮质激素的作用、调节NK细胞免疫功能、参与细胞增殖与生存、细胞迁移、DNA损伤和细胞周期的调控等。MIF在急性和慢性炎症病理过程中发挥着重要作用，如感染性休克、风湿性关节炎和动脉粥样硬化等。除此之外，大量研究证实MIF在多种肿瘤中高表达，例如：黑色素瘤、神经胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌和胃癌等，而与其紧邻的非癌细胞中MIF表达无明显增加。不仅如此，MIF的表达水平还与多种肿瘤患者的生存期密切相关，提示MIF可能与肿瘤的侵袭和转移有关。因此，MIF可能是炎症反应与肿瘤发生的纽带，在肿瘤发生发展的过程中发挥着重要作用。本课题组前期研究结果证实MIF在食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cellcarcinoma, ESCC）中高表达，不但与ESCC的TNM分期呈正相关，还与ESCC患者术后长期生存呈负相关。故本研究采用慢病毒MIF shRNA靶向沉默其在ESCC细胞中的表达，确定MIF沉默后对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移与转移、体内外致瘤性等细胞生物学行为的影响。目的通过分析ESCC细胞中MIF靶向沉默后对细胞恶性生物学行为的影响，探讨MIF促进ESCC发生发展的分子机制，并为MIF靶向分子治疗奠定理论基础。方法提取EC细胞（EC1、EC109、EC9706、NE3）和食管永生化细胞（NEC、NE6）的总RNA，反转录之后进行PCR扩增检测MIF的表达水平；选取MIF高表达的ESCC细胞进行siRNA介导的MIF表达沉默，免疫印迹（Western blot）验证MIF沉默效率；选取特异性MIF siRNA序列，构建慢病毒MIF shRNA，感染高表达MIF的ESCC细胞系，嘌呤霉素筛选MIF稳定沉默的亚克隆（ESCC sh-MIF）；然后采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）、Transwell、软琼脂克隆（Soft agar）和平板克隆形成实验分别检测MIF沉默对ESCC细胞增殖、迁移与转移、体外成瘤能力和克隆形成能力的影响；流式细胞仪检测细胞周期与凋亡情况；探讨MAPK/ERK和PI3K/Akt信号转导通路在MIF促进ESCC演进过程中的作用；裸鼠皮下植入慢病毒MIF shRNA靶向沉默的NE3sh-MIF与NE3sh-MOCK稳定株，观察记录裸鼠的出瘤时间与瘤体生长情况，5周后解剖并应用Western blot与免疫组化（Immunohistochemisty, IHC）验证MIF和ki67的表达情况；此外，应用MIF互变异构酶活性拮抗剂ISO-1（100uM）处理MIF高表达的ESCC细胞，探讨MIF互变异构酶活性对ESCC细胞恶性生物学行为的影响。结果RT-PCR结果显示MIF在ESCC细胞高表达，4株ESCC细胞均高表达MIF；3个MIF特异性siRNA（siRNA-101、373、535）均能高效沉默MIF在ESCC细胞中表达；经慢病毒MIF shRNA感染高表达MIF的ESCC系及嘌呤霉素筛选，共建立了4株MIF稳定沉默的亚克隆（NE3sh-MIF、EC1sh-MIF、EC109sh-MIF、EC9706sh-MIF），MIF沉默后的ESCC sh-MIF细胞的增殖、迁移与转移、致瘤能力均有不同程度的降低，MIF沉默导致pERK、AKT及pAKT表达水平下降，细胞S期阻滞，但是并未见明显的细胞凋亡；NE3sh-MIF组裸鼠出瘤晚而且生长缓慢，IHC结果显示荷瘤鼠瘤组织中MIF和Ki67表达降低；MIF互变异构酶活性拮抗剂ISO-1（100uM）并不能抑制高表达MIF的ESCC细胞的生长及体外瘤细胞的非依赖性生长。结论1.慢病毒MIF shRNA靶向沉默MIF能够显着抑制ESCC细胞增殖、迁移和转移及裸鼠皮下移植瘤的生长；2. MIF可能通过激活MAPK/ERK、PI3K/Akt信号通路促进ESCC恶性演进过程；3. MIF及MAPK/ERK、PI3K/Akt信号通路可能成为ESCC分子治疗的有效靶点。