脂肪组织在人体中是一个重要的能量稳态调节器，脂肪蓄积过多可能导致胰岛素抵抗，这是包括2型糖尿病、高脂血症、动脉粥样硬化和高血压病等代谢综合征发病的“共同土壤”。机体的脂肪含量是由脂肪细胞的体积和数目决定的。在分化成熟的脂肪细胞中，增加TG储存可以导致细胞体积的增大，而脂肪细胞数目的增加则是由于前脂肪细胞过度增殖及分化造成的。因此，减少机体脂肪含量的方法包括降低脂肪细胞内脂肪含量(通过影响脂肪合成或脂肪分解)，或抑制前脂肪细胞向脂肪细胞分化，或促进前脂肪细胞和脂肪细胞的凋亡。传统的减肥方法主要是减少能量摄入和增加体育锻炼而降低脂肪细胞内的脂肪含量，而传统方法减肥成功者只是脂肪细胞变小而数量不变，这些方法获得的体重减轻往往难于长期持续，甚至可能出现体重反弹，因此，能否通过其它更好的途径来防治肥胖成为关注的焦点。　　 脂肪细胞起源于骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，经过MSCs→前脂肪细胞(Preadipocytes)→成熟脂肪细胞→脂解作用(Lipolysis)→凋亡，完成整个生命周期。在脂肪细胞的生命周期中，MSCs首先形成为前脂肪细胞，前脂肪细胞经过生长抑制、克隆性增殖和一系列基因表达的变化，细胞内脂滴逐渐增加，进而形成成熟脂肪细胞。在脂肪分化过程中，过氧化物增殖体激活受体γ(PPARγ)和CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)是调节脂肪形成最主要的转录因子。脂肪细胞在生命周期的后期进入凋亡阶段，细胞凋亡是维持细胞稳态和更新的程序性死亡过程。凋亡的启动和信号传导机制比较复杂，主要是通过死亡受体途径(Death receptor)和线粒体途径。线粒体-半胱天冬氨酸酶(Caspase)家族途径在前脂肪细胞和脂肪细胞的凋亡过程中起关键作用。外界因素作用于细胞信号分子，引起线粒体膜电位的改变，细胞色素C释放增加，激活Caspase依赖的级联反应，从而引发细胞凋亡。在脂肪细胞的整个生命周期中，调节前脂肪细胞的分化，诱导前脂肪细胞或成熟脂肪细胞的凋亡，这对于减少脂肪细胞数目和体内脂肪储存具有重要意义。　　 大量研究显示，植物化学活性物质对于肥胖具有防治作用。白藜芦醇(Resveratrol，Res)是其中一种已被广泛研究的植物化学物，广泛存在于葡萄、花生、葡萄酒和其它天然植物或果实当中，具有广泛的药理学效应。Res的生物学效应包括抗炎症、抗氧化、抗白血病、神经保护作用，同时可作为肿瘤化学治疗和化学预防的药物。在多种类型的肿瘤细胞中，Res可促进细胞周期阻滞、抑制细胞增殖并且诱导细胞凋亡。而且有研究发现，Res可抑制前脂肪细胞分化过程中脂肪的合成，并且可促进分化成熟脂肪细胞的凋亡。然而，Res对于前脂肪细胞增殖、分化及凋亡的影响及相关机制仍未明确。本文推测Res可能影响脂肪细胞生命周期各阶段，从而对肥胖及代谢综合征有预防和治疗作用。　　 目的：　　 1、研究并探讨Res对前脂肪细胞的凋亡作用及可能机制。　　 2、研究并探讨Res对前脂肪细胞分化的抑制作用及可能机制。　　 方法：　　 1、Res对前脂肪细胞的凋亡作用。　　 (1)培养3T3-L1前脂肪细胞，用WST-1染色法测定Res对细胞增殖的影响，通过LDH漏出率实验评价Res对细胞膜的损伤作用。用Hoechst 33258染色细胞核，在荧光显微镜下观察Res对细胞核的作用，在透射电子显微镜下观察Res对细胞凋亡超微结构的改变。用流式细胞仪测定药物作用后细胞周期、线粒体膜电位、细胞凋亡率的改变。　　 (2)用免疫细胞荧光实验对Sirt1、Survivin进行细胞内的定位，在荧光显微镜下观察Res对Sirt1蛋白表达的影响。用Western blot实验测定Res作用后Sirt1、p-AMPK、AMPK、p-AKT、AKT、Survivin、Cyt C、Cleaved Caspase 9和Caspase 3蛋白的表达变化。　　 (3)添加相关位点(Sirt1、AMPKα、Survivin)的siRNA或特异性抑制剂(Wortmannin、Z-LEHD-FMK、Z-DEVD-FMK)或激动剂(AICAR)，用WST-1法测定细胞增殖的变化，用流式细胞仪测定线粒体膜电位、细胞凋亡率的变化，用Western blot实验测定Sirt1、p-AMPK、p-AKT、Survivin、Cyt C、Cleaved Caspase 9和Caspase 3蛋白的表达变化。　　 2、3T3-L1前脂肪细胞的分化。　　 (1)用“鸡尾酒”方法诱导分化3T3-L1前脂肪细胞，在光学显微镜下观察细胞分化过程的形态学变化，用油红O染色比色法测定细胞分化过程中脂肪含量的变化。　　 (2)用Real time PCR实验和Western blot实验分别测定细胞分化不同时间点Sirt1、PPARγ、C/EBPα的mRNA和蛋白质表达变化。　　 3、Res对3T3-L1前脂肪细胞分化的抑制作用。　　 (1)在光学显微镜下观察Res对细胞分化过程中形态学的改变，用油红O染色比色法测定Res对细胞分化过程脂肪含量的改变。　　 (2)用Real time PCR实验和Western blot实验测定Res作用后脂肪细胞的Sirt1、PPARγ、C/EBPα的mRNA和蛋白质表达变化，同时测定脂肪细胞因子脂联素和瘦素的mRNA表达变化。　　 (3)观察NAM对细胞分化过程形态学的改变，测定NAM对细胞分化过程脂肪含量的改变。用Western blot实验测定NAM作用后脂肪细胞的Sirt1、PPARγ、C/EBPα蛋白的表达变化。　　 结果：　　 1、Res对前脂肪细胞的凋亡作用。　　 (1)Res抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖，增加LDH漏出率，具有时间和剂量依赖效应(P＜0.01)。经过Res作用后，细胞核染色质高度凝集，甚至出现DNA断裂，细胞的超微结构也有改变，线粒体肿胀，疏松变性，内质网扩张，胞浆出现大量的空泡。Res作用后细胞周期出现S期阻滞，线粒体膜电位明显下降，细胞凋亡率上升(P＜0.05或P＜0.01)。　　 (2)Sirt1蛋白在3T3-L1前脂肪细胞的细胞核和细胞浆中均有表达，Survivin蛋白仅在细胞浆中表达。Res作用后细胞的Sirt1、p-AMPK、CytC(Cyto)、Cleaved Caspase 9、Cleaved Caspase 3蛋白表达上升，p-AKT、Survivin蛋白表达下降，AMPK、AKT、Cyt(Total)的蛋白表达无明显变化。　　 (3)Sirt1siRNA干扰后前脂肪细胞增殖能力上升，线粒体膜电位升高，细胞凋亡率下降(P＜0.05或P＜0.01)，Sirt1、p-AMPK、CytC(Cyto)、CleavedCaspase9、CleavedCaspase3蛋白表达下降，p-AKT、Survivin蛋白表达上升，说明Res通过激活Sirt1而促进细胞凋亡，且Sirt1位于其它蛋白上游。通过AMPKα、SurvivinsiRNA干扰或特异性抑制剂(Wortmannin、Z-LEHD-FMK、Z-DEVD-FMK)或激动剂(AICAR)做相关处理，证实Sirt1可通过激活AMPK，或抑制AKT磷酸化从而抑制Survivin表达，进而促进CytC从线粒体释放到胞浆，依次激活Caspase 9和Caspase 3，最终诱导细胞凋亡。　　 2、3T3-L1前脂肪细胞的分化。　　 (1)3T3-L1前脂肪细胞表现为成纤维细胞样形状，多为梭形或多角形，胞浆中无脂滴。随着细胞分化的进展，胞质内的脂滴逐渐增多，细胞的形态由多角形变为椭圆形或圆形，小脂滴大量融合成大脂滴，细胞核被推向细胞的边缘，成为成熟的脂肪细胞，细胞的相对脂肪含量随时间的延长明显升高(P＜0.01)。　　 (2)与前脂肪细胞相比，分化过程不同时间点Sirt1、PPARγ和C/EBPα的mRNA表达水平上升(P＜0.01)。Western blot检测结果与之变化趋势一致。　　 3、Res对3T3-L1前脂肪细胞分化的抑制作用。　　 (1)Res作用后分化成熟的脂肪细胞数目明显减少，Res对细胞分化的抑制率随着剂量增加而升高(P＜0.01)。　　 (2)与对照组相比，Res组脂联素和瘦素mRNA表达水平下降，差异有统计学意义(P＜0.01)。随着Res剂量的增加，脂肪细胞Sirt1的mRNA水平逐渐升高，而PPARγ、C/EBPα的mRNA水平逐渐下降(P＜0.01)，Western blot检测结果与之变化趋势一致。　　 (3)NAM作用后细胞分化能力上升，与对照组相比，NAM组Sirt1蛋白表达下降，而PPARγ、C/EBPα蛋白表达升高。　　 结论：　　 1、Res抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖并促进细胞凋亡。　　 2、Res激活Sirt1，增加AMPK磷酸化水平，并可降低AKT磷酸化而抑制Survivin表达，两条通路均可促进CytC释放到胞浆，激活Caspase 9和Caspase 3，最终诱导细胞凋亡。　　 3、Res抑制3T3-L1前脂肪细胞分化，机制是通过激活Sirt1而抑制PPARγ和C/EBPα的表达。