背景与目的皮肤黑色素瘤是起于皮肤表皮基底层的黑色素细胞的皮肤恶性肿瘤。黑色素瘤极易发生转移,是皮肤三大恶性肿瘤中最致命的一种。临床上对于黑色素瘤,尤其是发生转移的皮肤黑色素瘤病例的治疗一直是一个很棘手的问题。黑色素瘤细胞通常是由被激活的细胞外信号调节激酶(ERK)途径进行调节,该信号由BRAF激活突变所诱导。BRAF是RAF家族的一种蛋白激酶,其功能位于RAS下游,通过磷酸化MEK激活ERK来帮助刺激细胞生长和存活。临床上用于治疗皮肤恶性黑色素瘤的BRAF抑制剂可短暂有效,但是大多数患者会产生耐药性。肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)指的是肿瘤在发生发展过程中所处的局部环境,构成这一局部环境的细胞成分复杂,包括但不限于免疫细胞、血细胞、内皮细胞、脂肪细胞和细胞基质。肿瘤基质是肿瘤微环境的重要组成部分,主要由成纤维细胞和细胞外基质构成。在过去的几十年里,越来越多的研究成果证实TME在决定疾病进展和治疗结果方面的作用变得越来越明显。肿瘤细胞与微环境之间的相互作用机制非常复杂,但可分为两大类:即接触式和非接触式途径。其中接触式途径涉及细胞-细胞和细胞外基质粘附分子的接触依赖性机制。而在非接触式途径中,诸多可溶性分子,如生长因子,趋化因子和细胞因子,以及可溶性的亚细胞器(包括微泡和外泌体)等在整个过程中起到至关重要的作用,最终,这些相互作用通过分泌和旁分泌机制,完成与恶性肿瘤细胞的相互作用。肿瘤微环境肿瘤基质细胞中最主要的细胞成分为成纤维细胞。最近,越来越多的相关研究成果显示,肿瘤基质组织与肿瘤抗药性的产生有很大关系,提示癌症治疗应该包括靶向基质细胞来抑制肿瘤的策略。ATF3(activating transcription factor 3,ATF3)为 ATF/CREB 家族重要成员之一。作为重要的转录因子,ATF3在不同组织中表现的功能可能存在差异。ATF3基因在肿瘤发展中可能会表现出促癌基因和抑癌基因正反两方面作用。本课题组前期研究结果显示在人表皮角质形成细胞中,上调ATF3表达水平会抑制p53基因依赖的细胞衰老,从而促进皮肤鳞状细胞癌的发生发展。人真皮成纤维细胞中亦有ATF3基因表达,但对其功能的研究甚为少见,目前为止只有一篇报道指出低表达ATF3的成纤维细胞可转化为癌症相关成纤维细胞表形,并最终促进了皮肤鳞状细胞癌的发展。但是人真皮成纤维细胞ATF3与皮肤黑色素瘤之间的关系尚未见报道。为填补这一空白,本研究首先拟通过对皮肤黑色素瘤临床病例标本进行检测,明确ATF3在临床黑色素瘤基质细胞中表达情况。随后利用ATF3过表达和敲除等手段,借助共培养体系和条件培养基等方法,通过体外体内实验检测原代人真皮成纤维细胞对皮肤黑色素瘤细胞生长与迁移等生物学行为的影响,并针对一系列指标进行检测以明确机制。最后本研究将尝试验证药物诱导ATF3增高表达的人真皮成纤维细胞对人皮肤黑色素瘤细胞的影响,以期将来为皮肤黑色素瘤的治疗提供新的思路和方案。方法1.对皮肤恶性黑色素瘤临床病例标本ATF3表达水平的检测首先收集病理诊断为皮肤黑色素瘤的临床病例肿瘤石蜡标本,利用免疫组织化学染色技术对石蜡切片进行染色,后利用RNAscope原位杂交染色技术,对免疫组织化学染色结果进行验证。随后利用免疫荧光双重染色技术,检测人正常真皮成纤维细胞、人皮肤良性黑色素痣以及人皮肤黑色素瘤肿瘤基质组织中成纤维细胞ATF3表达水平,并对结果进行统计学分析。2.人真皮成纤维细胞ATF3对恶性黑色素瘤细胞生长与迁移影响体外及体内实验检测首先分离原代人真皮成纤维细胞并培养。利用已有针对人ATF3基因过表达和CRISPR/Cas9基因敲除的慢病毒和逆病毒来制备相应的病毒,并用病毒感染人真皮成纤维细胞已达到ATF3过表达及敲除。利用qRT-PCR以及Western Blot等技术对ATF3表达效果进行验证。利用共培养体系,以及收集ATF3不同表达水平的成纤维细胞条件培养基来培养黑色素瘤细胞,然后利用CCK-8、细胞克隆形成实验、transwell以及细胞划痕实验等方法,检测ATF3过表达或敲除的人真皮成纤维细胞对皮肤黑色素瘤生长与迁移能力的影响。采用8周nude/nude裸鼠,随机分为二组,每组三只,将ATF3过表达的人真皮成纤维细胞与皮肤黑色素瘤细胞混合,利用裸鼠皮下成瘤实验检测其对黑色素瘤细胞体内成瘤能力的影响。3.人真皮成纤维细胞ATF3对恶性黑色素瘤细胞生长与迁移影响分子机制的检测利用qRT-PCR技术,对过表达或敲除ATF3基因的人真皮成纤维细胞相应炎性因子等基因变化进行检测,筛选备选下游基因。利用ELISA技术,对条件培养基中相应炎性因子分泌蛋白水平变化进行检测,以验证qRT-PCR结果。利用候选基因相应的重组蛋白或者抑制剂,结合ATF3基因表达改变的人真皮成纤维细胞来源的条件培养基,再利用CCK-8、细胞克隆形成实验、transwell以及细胞划痕实验等方法,检测候选基因重组蛋白或抑制剂对皮肤恶性黑色素瘤细胞生长与迁移能力的影响。利用Western Blot技术,对经条件培养基和候选基因重组蛋白或者抑制剂处理的黑色素瘤细胞相应通路的蛋白磷酸化水平变化进行检测,明确具体信号通路。4.人真皮成纤维细胞ATF3对恶性黑色素瘤细胞生长与迁移影响分子机制体内验证采用8周nude/nude雌性裸鼠,随机分为三组,每组三只。将经ATF3基因过表达的人真皮成纤维细胞与黑色素瘤细胞按比例混合,植入裸鼠背部皮下。对其中对2组实验组,增加候选基因重组蛋白或者抑制剂给药处理。3周后观察三组裸鼠肿瘤成瘤率、肿瘤体积以及肿瘤重量。5.药物诱导ATF3基因表达的人真皮成纤维细胞对黑色素瘤细胞生长的检测首先利用细胞培养、qRT-PCR以及Western Blot等技术,明确候选药物对人真皮成纤维细胞ATF3基因和蛋白表达水平变化的影响及其变化规律。其次收集经药物处理后的人真皮成纤维细胞条件培养基,利用CCK-8等技术检测其对黑色素瘤细胞生长能力的影响,并利用qRT-PCR以及ELISA等技术检测相应基因变化水平以及蛋白变化水平。最后将经药物预处理的人真皮成纤维细胞与皮肤恶性黑色素瘤细胞混合,利用随机两组8周龄nude/nude雌性裸裸鼠皮下成瘤实验检测其对黑色素瘤细胞体内成瘤能力的影响。以上实验至少重复3次。结果1.对皮肤恶性黑色素瘤临床病例标本ATF3表达水平的检测结果免疫组化和RNAscope原位杂交染色结果显示,在皮肤恶性黑色素瘤肿瘤基质组织中,ATF3呈低表达。免疫荧光双重染色结果显示,与人真皮组织和人皮肤良性黑色素痣基质组织相比,人皮肤黑色素瘤肿瘤基质组织中成纤维细胞ATF3表达水平呈低表达,且组间差异具有统计学意义。2.人真皮成纤维细胞ATF3对恶性黑色素瘤细胞生长与迁移影响体内体外实验检测结果与对照组相比,与过表达ATF3人真皮成纤维细胞共培养能抑制黑色素瘤细胞生长与迁移,实验组与对照组结果差异具有显著统计学意义;与对照组相比,与CRISPR/Cas9基因敲除ATF3人真皮成纤维细胞共培养对黑色素瘤细胞生长与迁移无明显抑制和促进作用。与对照组相比,与过表达ATF3人真皮成纤维细胞条件培养基抑制黑色素瘤细胞生长与迁移,实验组与对照组结果差异具有显著统计学意义。与对照组相比,过表达ATF3人真皮成纤维细胞混合组黑色素瘤细胞裸鼠体内成瘤率与成瘤大小受到抑制,实验组与对照组结果差异具有显著统计学意义。3.人真皮成纤维细胞ATF3对恶性黑色素瘤细胞生长与迁移影响分子机制的检测qRT-PCR检测结果显示,在过表达ATF3基因的人真皮成纤维细胞中,包括IL-6、IL-8、IL-1β、COX1-3等炎性因子mRNA水平显著降低;CRISPR/Cas9基因敲除ATF3人真皮成纤维细胞组与对应对照组相比,仅IL-6、IL-8mRNA水平出现增高,其他基因未见显著变化。ELISA检测结果显示,与相应对照组相比,过表达ATF3基因人真皮成纤维细胞条件培养基中,IL-6,IL-8蛋白含量水平显著降低,且差异具有统计学意义。CRISPR/Cas9基因敲除ATF3人真皮成纤维细胞组条件培养基与对应对照组条件培养基相比,IL-6,IL-8蛋白含量水平升高不显著。利用人重组白介素6(rhIL-6)对黑色素瘤细胞系进行处理结果显示,能够促进其生长与迁移。Western Blot结果显示,过表达ATF3基因的人真皮成纤维细胞条件培养基抑制黑色素瘤细胞STAT3蛋白磷酸化水平,rhIL-6的处理也能够促进黑色素瘤细胞STAT3蛋白磷酸化。结果表明过表达ATF3人真皮成纤维细胞主要通过调节黑色素瘤细胞IL-6/STAT3信号通路来抑制其生长与迁移。4.人真皮成纤维细胞ATF3对恶性黑色素瘤细胞生长与迁移影响分子机制的体内验证裸鼠体内成瘤实验结果显示,与对照组相比,过表达ATF3人真皮成纤维细胞混合组黑色素瘤细胞裸鼠体内成瘤率与成瘤重量明显受到抑制,黑色素瘤细胞与过表达ATF3人真皮成纤维细胞混合组加rhIL-6给药组体内成瘤率及肿瘤重量则得到促进,表明高表达ATF3人成纤维细胞是通过抑制IL-6来抑制黑色素瘤的生长。5.药物诱导ATF3基因表达的人真皮成纤维细胞对黑色素瘤细胞生长的检测结果qRT-PCR及Western Blot结果显示苯乙双胍或环孢素A促进人真皮成纤维细胞ATF3基因及蛋白表达,同时抑制IL-6及IL-8的表达与分泌。苯乙双胍或环孢素A预处理人皮成纤维细条件培养基显著抑制黑色素瘤细胞体外生长。裸鼠体内成瘤结果显示,与对照组相比,与环孢素A预处理的人真皮成纤维细胞混合组黑色素瘤细胞裸鼠体内成瘤率与成瘤重量受到抑制。结论1.人皮肤恶性黑色素瘤肿瘤基质组织中成纤维细胞ATF3水平呈低表达。2.过表达ATF3基因抑制人真皮成纤维细胞多种炎性因子表达与分泌,特别是抑制IL-6的表达尤为显著。3.过表达ATF3人真皮成纤维细胞主要通过调节IL-6/STAT3信号通路抑制皮肤恶性黑色素瘤细胞生长与迁移。4.苯乙双胍或环孢素A可诱导人真皮成纤维细胞ATF3基因表达,同时抑制人真皮成纤维细胞炎性因子IL-6及IL-8的表达与分泌。5.苯乙双胍或环孢素A预处理诱导ATF3表达的人真皮成纤维细胞抑制皮肤恶性黑色素瘤细胞生长。