布拉酵母菌(Saccharomyces.boulardii)是1920年由法国科学家Henri Boulard从印尼荔枝等水果中分离得到的一种益生性酵母菌。在欧美、非洲等国家地区,布拉酵母菌(Sb)已经做为微生态制剂广泛用于预防和治疗婴幼儿腹泻、旅行者腹泻、肠道手术后恢复及肠道环境平衡的调节。布拉酵母菌已经成为最有价值的益生菌之一。对布拉酵母菌大量研究主要集中在生产和临床使用,对其抗炎及免疫调节的分子机制研究相对较少,以及对其遗传改造以提高其益生作用和效果也少有研究和报道。为了研究布拉酵母菌抗炎作用及提高其益生效果,我们通过敲除布拉酵母菌VRP1基因,构建β-葡聚糖含量升高的缺失变异菌株,对比研究THP1基因缺失突变株(Sb-thp1)和VRP1基因缺失变异株(Sb-vrp1)的形态大小、细胞壁结构、生长速度等表型,对基因缺失突变株进行安全性评价,通过DSS肠炎来研究布拉酵母菌及其缺失变异株预防肠炎能力,筛选益生能力较好的菌株,并对益生机制进行探讨。1.布拉酵母菌VRP1基因缺失变异株的构建酵母菌β-葡聚糖占母菌细胞壁组成的50%以上,是一种很好的天然免疫增强剂,能提高机体的非特异性和特异性免疫作用,因此构建、筛选高含量β-葡聚糖的布拉菌变异株能丰富β-葡聚糖的自然资源,拓宽布拉酵母菌应用领域。我们应用本实验室布拉酵母菌Cre-lox P基因敲除系统,把VRP1基因从布拉酵母菌基因组中完全删除,利用PCR鉴定基因敲除株,获得VRP1基因缺失变异株。2.布拉酵母菌及其基因缺失变异株的表型研究我们对布拉酵母菌野株及其基因缺失变异株表型进行对比研究,包括形态大小、细胞壁组成、生长速度、细胞壁敏感性、体外对人工胃酸、胆汁盐的耐受性及小鼠体内滞留情况等。扫描电镜观察发现,与Sb比较,Sb-thp1变圆,而Sb-vrp1变得细长。透射电镜观察发现,与Sb、Sb-thp1相比,Sb-vrp1总细胞壁厚度分别增加13.4%和10.7%;甘露聚糖单层厚度分别增加25.1%和19.5%;葡聚糖单层厚度分别增加10.9%和4.2%。与Sb相比,Sb-vrp1生长速度无差别,Sb-thp1生长速度减慢。在对刚果红的敏感性上,Sb、Sb-thp1和Sb-vrp1细胞壁之间比较没有差别。在体外抗不同pH胃酸试验中,Sb、Sb-thp1和Sb-vrp1存活率比较差异不显著;在体外抗不同浓度胆汁盐试验中,Sb-vrp1存活率显著高于Sb和Sb-thp1。小鼠体内滞留试验发现,与Sb比较,Sb-thp1和Sb-vrp1滞留时间分别多8h和12h。综上所述,从布拉酵母菌基因组敲除VRP1和THP1基因会对布拉酵母菌表型产生一定程度的影响。3.布拉酵母菌基因缺失株安全性评价通过急性毒性试验和慢性重复性试验,对基因缺失株sb-vrp1与sb-thp1进行安全性评估。结果发现,基因缺失株sb-vrp1与sb-thp1在一次性大剂量(2×109个菌)急性毒性试验中,动物临床表现、体重变化、脏器及血液指标等方面与正常组没有差别,机体没有表现出任何毒性反应。将基因缺失株sb-vrp1与sb-thp1分高(2×108个菌)、中(1×108个菌)、低(2×107个菌)三种剂量,每天灌服小鼠,连续进行二十八天的慢性重复性毒性试验。与对照组比较,基因缺失株各剂量组,在临床表现、体重变化、脏器及血液指标等方面没有区别。另外,同一菌种,剂量高低对机体正常生理、血液指标没有影响,而且同一剂量的不同菌株,也没有表现出差别。以上这些结果表明基因缺失株sb-vrp1与sb-thp1对小鼠是安全的。4.dss结肠炎动物模型的建立dss急性结肠炎动物模型是研究人自然结肠炎常用的模型,重复性好,容易操作,被广泛使用。为了研究布拉酵母菌及其缺失变异株预防治疗结肠炎的作用,我们选择6周龄c57bl/6j雌性小鼠为试验动物,来建立dss结肠炎动物模型,对dss使用剂量、检测指标进一步试验,探讨最佳的试验条件。结果表明,3%dss连续饮用8天能成功建立dss急性结肠炎动物模型;以疾病活动指数和病理组织学得分作为评价标准来评价dss结肠炎;疾病活动指数是体重损失得分与潜血得分的平均数。当体重没有变化或者上升时,体重损失得分为0;当体重下降1?5%,体重损失得分为1;当体重下降5?10%,体重损失得分为2;当体重下降10?15%,体重损失得分为3;当体重下降超过15%,体重损失得分为4。粪便正常均一没有潜血,潜血得分为0;粪便柔软带有潜血,潜血得分为1;非常柔软并带有血迹,潜血得分为2;粪便水样带有可见直肠出血,潜血得分为3;严重血便,潜血得分为4。病理组织学得分根据淋巴细胞侵润和上皮黏膜损伤程度来计算。没有淋巴细胞侵润和肠道上皮黏膜完整正常,病理组织得分为0;有少量的淋巴细胞侵润,病理组织得分为1;中性粒细胞侵润和黏膜轻度水肿,病理组织得分为2;肠道黏膜局灶性糜烂和溃疡,病理组织得分为3;肠道黏膜大的多处溃疡,病理组织得分为4;肠道黏膜结构完全破坏,病理组织得分为5。5.布拉酵母菌及其基因缺失变异株对dss结肠炎的预防作用我们通过dss结肠炎模型来研究布拉酵母菌及其基因缺失变异株对dss结肠炎的预防作用。对4周龄c57bl/6j雌性小鼠每只每天分别灌胃108个布拉酵母菌及其基因突变变异株,连续进行22天,从第14天开始连续8天使用3%DSS诱导结肠炎,观察布拉酵母菌及其基因缺失突变株预防作用。我们分析了布拉酵母菌及其基因缺失突变株对DSS肠炎预防效果,对小鼠炎症因子和屏障相关基因表达及免疫系统的影响。Sb-vrp1和Sb-thp1能够下调DSS结肠炎疾病活动指数,减轻结肠病理组织损伤,缓解结肠病变,并能使脾脏指数和MPO酶活力接近于对照组。通过RT-PCR检测,发现Sb-vrp1能下调结肠中促炎因子IL-6、IL-17、iNOS、TNF-α、MMP-2和MMP-9等基因表达,上调MUC-2、ZO-1和Occludin等肠道屏障相关基因的表达,从而达到减轻炎症,增强肠壁的屏障作用,来达到预防效果。布拉酵母菌及其基因缺失变异株能够调节抗体水平,其中Sb-vrp1使正常小鼠SIgA浓度水平升高175%,使DSS肠炎小鼠SIgA浓度水平升高61.7%,同时对肠系膜淋巴结中淋巴细胞比例也产生影响。在DSS结肠炎中,Sb-vrp1可有效下调MLN中B淋巴细胞群和CD4+CD25+T淋巴细胞群比例,上调T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞亚群和CD4+T淋巴细胞亚群比例,来维持免疫系统平衡和稳定。这些结果说明布拉酵母菌及其基因缺失变异株对小鼠细胞免疫和体液免疫具有一定影响,可能通过SIgA和肠系膜淋巴结中的T淋巴细胞群及其亚群的变化来缓解DSS肠炎。