除了病毒本身的因素外,宿主自身的易感性在流感疾病的发生和发展过程中发挥重要作用。研究发现病原体感染机体时,机体主要通过直接抗病毒作用与增强机体对病原体的耐受能力发挥自我保护作用。当机体无法有效发挥这两种作用,会引起严重感染导致死亡,被称为流感的“易感个体”。研究表明新生儿、老年人、患有基础代谢疾病及疲倦或应激负荷下的人群属于感染流感病毒的“易感人群”,且这部分人群感染流感后死亡率显著升高,但关于这些因素是如何增加机体“易感性”的机理尚不明确。因此,深入研究流感“易感性”形成机制及如何降低机体“易感性”在防治流感病毒感染中具有重要意义。应激负荷能激活下丘脑-垂体-肾上腺(Hypothalamic pituitaryadrenal,HPA)轴增加糖皮质激素皮质酮(Cortisostone,CORT)的分泌,同时CORT能够调控先天性免疫反应保护机体抵御病原体感染。前期研究发现拘束应激负荷能增加小鼠对流感病毒的易感性。因此,本课题以拘束应激负荷与CORT负荷建立小鼠与细胞“易感性”模型,探索CORT在拘束应激负荷增强机体流感“易感性”的作用及机制。首先,本论文研究了拘束应激负荷诱导的应激激素CORT对小鼠流感病毒“易感性”的影响。将小鼠放置于50mL通风良好的离心管中拘束负荷18 h,小鼠于给药前1 d开始拘束负荷,拘束应激负荷18 h后第3 d以2×LD50的H1N1病毒经滴鼻感染小鼠,实验组小鼠于拘束负荷后开始每天皮下注射1 mg/kgCORT或25 mg/kg米非司酮(Mifepristone,RU486),连续给药3 d,正常对照组、病毒组和拘束病毒模型组小鼠给予等量溶剂聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)。感染流感病毒后连续观察21d或者4d,检测小鼠感染流感病毒后的发病率、死亡率与肺组织中的病毒量(Nuclear protein,NP)变化。实验结果表明,拘束应激负荷小鼠与CORT负荷小鼠感染流感病毒后发病率、死亡率明显升高,肺组织中的病毒复制水平(NP蛋白表达)明显增加,且肺部病理损伤显著加剧,而皮质酮受体抑制剂RU486能够改善上述过程。以上实验结果提示,应激激素CORT增强了小鼠对流感病毒“易感性”。其次,研究应激激素CORT对线粒体抗病毒信号蛋白(Mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)通路的影响。病毒感染机体时,体内的MAVS被激活形成多聚体,mavs聚集体激活irf3与nf-κb诱导产生大量i型干扰素(interferon-i,ifn-i)与抗病毒蛋白(antiviralprotein,avp)从而抑制病毒的感染。本实验探讨了拘束应激负荷增加小鼠流感病毒“易感性”是否与应激诱导的cort调控mavs抗病毒信号通路活性有关。将昆明种(km)小鼠随机分为以下4组:正常对照组(control),病毒组(virus),拘束病毒模型组(stress+virus),ru486组(stress+virus+ru486)。小鼠于给药前1d开始拘束负荷,拘束负荷18h后第3d以2×ld50的h1n1病毒感染机体,实验组小鼠于拘束负荷后开始每天皮下注射25mg/kgru486,连续给药3d,正常对照组、病毒组和拘束病毒模型组给予等量溶剂peg。将小鼠于感染病毒后的第4d处死取肺组织,检测肺组织中mavs及mavs聚集体蛋白表达水平。实验结果显示,病毒感染增强了小鼠肺组织中mavs及mavs聚集体蛋白表达;与病毒组相比,拘束病毒模型组小鼠肺组织中的mavs及mavs聚集体蛋白表达显著下降,ru486上调了两者蛋白表达。以上结果说明应激激素cort能够通过抑制mavs蛋白及活性,降低机体抗病毒信号。mavs活化能够促进irf3磷酸化与nf-κb活化,从而调控ifn-β应答。为了进一步考察应激诱导的cort降低ifn-β应答提高小鼠流感“易感性”是否受nf-κb调控,本研究采用nf-κb抑制剂bay11-7082探讨nf-κb信号通路在cort负荷a549细胞感染流感后对ifn-β的影响。实验结果表明,与单独cort负荷细胞相比,cort负荷的a549细胞感染流感病毒后nf-κb蛋白表达增强,诱导炎症因子(tnf-α与il-6)释放增加;与cort病毒模型组细胞相比,nf-κb抑制剂bay11-7082显著降低了细胞中nf-κb表达水平,同时tnf-α与il-6释放减少,提示cort能直接激活体内的nf-κb信号诱导炎症反应。但是bay11-7082对cort负荷的a549细胞感染流感病毒后np与ifn-β表达无影响,说明细胞中ifn-β应答受mavs调控而与nf-κb信号通路无关。以上结果表明拘束应激负荷诱导的应激激素cort一方面抑制了mavs抗病毒信号通路减少ifn-β应答,另一方面直接激活nf-κb信号通路诱导了炎症因子释放,两者共同作用提高了机体流感“易感性”。再次,mavs抗病毒信号减弱是拘束应激负荷诱导应激激素cort降低流感病毒“易感性”的重要机制。流感病毒能利用蛋白泛素化途径调控机体先天性免疫信号转导,而线粒体融合蛋白2(mitofusin2,mfn2)能够抑制mavs抗病毒信号降低ifn应答促进病毒感染。因此,本课题从拘束应激负荷与cort负荷对小鼠基因表达谱的影响,与体内mavs泛素化角度研究和探讨mfn2在应激激素cort调控mavs泛素化中的作用。(1)首先采用小鼠表达谱测序对拘束应激负荷与cort负荷小鼠进行基因表达水平的检测,发现cort负荷能够明显上调小鼠肺组织中与先天性免疫及抗病毒相关的vdac1、irf3、mfn2与jun基因水平,其中mfn2基因水平显著上调,但是mavs基因水平无明显影响,提示拘束应激负荷与cort负荷增强机体易感性可能与mfn2有关。接下来采用rt-pcr与westernblot方法检测拘束应激负荷与cort负荷对小鼠与a549细胞中mfn2与mavs的基因与蛋白表达影响。体内外实验结果显示,cort负荷能增强mfn2基因与蛋白表达,对mavs基因表达无影响,但是降低mavs蛋白表达,提示mfn2可能与应激激素cort提高机体流感“易感性”相关。(2)采用pires2-egfp-mfn2质粒转染a549细胞,探讨过表达mfn2对流感感染机体“易感性”的影响。质粒转染的a549细胞经cort负荷后感染h1n1病毒,观察细胞中np,ifn-β与ifitm3蛋白表达变化。实验结果表明过表达mfn2细胞感染流感病毒后np表达显著增强,ifn-β与ifitm3蛋白表达下降,说明应激激素cort上调了mfn2表达从而抑制了ifn-β应答。(3)进一步考察mfn2在cort调控mavs信号通路降低ifn-β应答中的作用。采用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-ip)实验验证mfn2与mavs在体内相互作用,结果证明了mfn2与mavs在细胞体内相互结合。采用co-ip与westernblot法相结合测定应激激素cort对病毒感染小鼠肺组织中mavs泛素化的影响。实验结果表明,与病毒组相比,拘束应激负荷与cort负荷小鼠肺组织中mavs泛素化显著增强,以上结果提示mfn2可能通过促进mavs泛素化抑制机体抗病毒信号通路。(4)采用pires2-egfp-mfn2质粒转染a549细胞,观察过表达mfn2对cort负荷a549细胞感染病毒后mavs泛素化的影响。实验结果显示,mfn2过表达促进了a549细胞感染病毒后mavs泛素化,提示应激激素cort通过上调mfn2促进了mavs泛素化降解。最后,考察mfn2调控mavs信号通路在天然小分子活性肽肌肽(carnosine)保护拘束应激负荷小鼠流感感染中的作用研究。课题组前期建立拘束负荷小鼠流感易感性模型,并用此模型评价出了许多天然产物对流感易感性的保护作用。其中,课题组前期研究发现天然小分子活性肽carnosine具有抗应激与抗氧化等多种生理活性,且能够提高流感感染小鼠的存活率,但是carnosine降低流感小鼠易感性是否与Mfn2调控MAVS信号通路有关尚未阐明。(1)采用拘束应激负荷小鼠感染流感病毒,观察流感小鼠肺指数、病毒复制及肺部病理损伤情况。实验结果显示,carnosine显著降低了拘束负荷小鼠感染流感病毒后的肺指数与病毒复制水平,减轻了肺部病理损伤。以上结果说明小分子活性肽carnosine能够对流感感染的应激负荷小鼠发挥保护作用。(2)探讨carnosine降低拘束应激负荷小鼠流感易感性是否与影响MAVS抗病毒信号通路有关。观察应激负荷小鼠感染流感后肺组织中IFN-β应答与MAVS、p-IRF3、NF-κB与p-IκB蛋白表达变化情况。实验结果表明,与模型组相比,carnosine增强了流感小鼠肺组织中IFN-β与IFITM3蛋白表达,上调了MAVS与p-IRF3蛋白表达水平,同时降低了NF-κB与p-IκB蛋白水平。以上结果说明carnosine能够激活MAVS抗病毒信号通路促进IFN-β应答从而降低机体流感易感性。(3)探讨Mfn2调控MAVS抗病毒活性在carnosine降低机体流感易感性中的作用。观察应激负荷小鼠感染流感后肺组织中MAVS与MAVS聚集体及Mfn2蛋白表达变化。实验结果显示,与模型组相比,carnosine提高了流感小鼠肺组织中MAVS与MAVS聚集体蛋白表达,降低了Mfn2蛋白表达,说明carnosine能通过Mfn2上调MAVS活性增强IFN应答降低机体流感易感性。综上所述,拘束应激负荷增加小鼠对流感病毒的易感性是通过CORT上调Mfn2介导MAVS泛素化抑制IFN应答。天然小分子活性肽carnosine通过下调Mfn2提高MAVS介导的IFN应答对流感感染应激负荷小鼠发挥保护作用。