本论文应用荧光置换探针技术,以乙型肝炎病毒在拉米夫定治疗过程中产生的耐药突变和多重耐药结核分枝杆菌为研究对象,考察荧光置换探针用于低GC含量和高GC含量突变基因的多位点检测情况,建立了可应用于多突变位点病原微生物检测的多色均相荧光PCR系统。快速有效的检测乙型肝炎病毒抗拉米夫定耐药突变,对于临床诊断和治疗具有重要的意义。本论文建立了于单管实时PCR实验中同时检测血清标本中存在的多个拉米夫定耐药突变的体系。应用4对标记了不同荧光基团的碱基特异性置换探针,通过单个实时PCR反应就能判断标本中包含了以下任何一种HBV DNA:野生型,rtM204突变型,野生和rtM204突变混合型,rtM204突变和rtL180突变混合型,野生、rtM204突变和rtL180突变混合型。我们考察了检测体系的灵敏度、特异性和检测杂合比例的能力,并应用该体系完成了50份已知包含拉米夫定耐药突变的HBV血清标本和36份HBeAg阳性的HBV血清标本的检测。检测结果表明,和DNA测序结果相比,该体系表现出更高的灵敏度和更强的检测杂合比例的能力。该方法可以检测出低至102 ~103 copies/mL的HBV,并且可以检测出在大量的野生型DNA中的5%的突变型DNA。应用这种高通量的检测体系能够对抗拉米夫定HBV进行更早的诊断。目前临床上用于检测结核分枝杆菌对抗菌药物的敏感性的方法,因为受到细菌生长速度的限制,一般需要数周的时间,不利于临床诊断和治疗。针对4种治疗结核的一线药物,在确定结核分枝杆菌存在的前提下,本论文建立了两个检测结核分枝杆菌耐药突变的体系:一是针对结核分枝杆菌抗利福平耐药突变中最常见的RNA聚合酶基因(rpoB)突变,建立了在单管PCR反应中实时检测rpoB核心位点发生的所有突变的体系。在结核分枝杆菌耐利福平分离株中,95%的突变发生在rpoB507位至533位27个氨基酸密码子(81bp)组成的区域内。应用4对标记了不同荧光基团的碱基特异性置换探针,覆盖rpoB 81bp的大部分区域,一旦所检测的区域发生了突变就会造成相应探针的荧光信号的消失,从而达到检测突变的目的。结果表明,该体系可以检测出低至5个拷贝的结核分枝杆菌,并且具有很高的特异性。应用该体系完成了9份已知基因型的结核分枝杆菌培养标本和123份痰标本的检测。痰标本中101份为野生型,5份526位点发生突变,16份531位点发生突变,1份526和531位点同时突变。所有检测结果均通过DNA测序验证。二是建立了同时检测三种一线药物的结核分枝杆菌耐药突变的荧光PCR检测方法。将荧光双链置换探针、实时PCR和多重PCR相结合,针对三种一线药物链霉素、异烟肼和乙胺丁醇中最常见的并且都是由于点突变而导致的耐药突变位点进行检测。应用该体系检测了9份已知基因型的结核分枝杆菌培养标本和118份痰标本,其中93份痰标本未发生突变,8份痰标本发生耐链霉素突变,6份痰标本发生耐异烟肼突变,1份痰标本发生耐乙胺丁醇突变,2份痰标本发生同时耐链霉素和异烟肼的突变,8份痰标本发生同时耐链霉素、异烟肼和乙胺丁醇的突变,所有检测结果均通过ARMS体系进行验证。两种检测结核分枝杆菌耐药突变的体系均具有极高的灵敏度和特异性,测定突变位点数目较现有技术有所提高,并且操作简便,检测快速,有望形成适合临床应用的筛查技术。该体系的建立,十分有利于结核病的早期诊断和指导医生用药。