论文部分内容阅读
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为豆科苜蓿属多年生草本植物,是世界上最重要的牧草资源,具有极高的饲用及生态价值。近些年,随着紫花苜蓿栽培面积的不断扩大,抗寒性弱成为限制紫花苜蓿向北方地区推广的主要因素,转入抗寒基因提高紫花苜蓿抗寒性是解决该问题的高效育种方法之一。本研究从拟南芥中克隆得到冷诱导转录因子AtCBFl基因,采用农杆菌介导法转入到优良紫花苜蓿品种中,通过转化植株分子检测、抗寒性及田间鉴定形成株系,筛选出了转AtCBFl基因抗寒高产的转基因紫花苜蓿新材料。主要研究结果如下：1.研究了紫花苜蓿品种、外植体以及激素组合配比等影响组培的再生因子,结果表明,组织培养最佳基因型为猎人河苜蓿；最佳外植体为下胚轴；最佳愈伤组织诱导培养基为SH+2.0mg · L-12,4-D+0.5 mg · L11 6-BA,愈伤组织继代培养基为MSO+0.5mg · L-1 NAA+1.0mg · L-1 6-BA+1.0mg · L-1 AgNO3和MS+0.3mg·L-1TDZ分化培养基为MS+0.2mg · L-1 KT。2.克隆了拟南芥冷诱导转录因子AtCBF1基因并构建了适于紫花苜蓿农杆菌遗传转化的植物表达载体PBI121-CBF1。3.紫花苜蓿遗传转化因子研究确定出最佳农杆菌抑制剂为350mg·L-1 Carb:最佳Kan筛选浓度为60mg·L-1；最佳受体基因型为猎人河苜蓿；最佳外植体为下胚轴；最适宜农杆菌菌液浓度OD600为0.4～0.6,侵染时间10min；AS最适浓度为10mg·L-1。4.利用农杆菌介导法将AtCBF1基因转入紫花苜蓿,获得了抗Kan的转基因紫花苜蓿植株。经PCR检测,部分转化植株扩增出了大小为650bp左右特异带,初步表明目的基因AtCBF1已经整合到紫花苜蓿基因组,进一步通过RT-PCR检测,结果显示外源基因AtCBF1在部分转化植株的转录水平上表达。5.抗寒性生理研究测定了转基因苜蓿相对电导率、脯氨酸含量、可溶性糖含量及丙二醛含量,结果显示转AtCBF1基因紫花苜蓿植株较对照抗寒性有所提高,转基因株系以T9、T11和T3的抗寒性相对较高,且T9株系抗寒性最强。6.研究了转基因苜蓿人工模拟冷冻天气抗寒性,叶片受害及恢复生长结果表明转基因紫花苜蓿植株表现出较强的耐低温胁迫能力,即过量表达AtCBF1基因的转基因紫花苜蓿的抗寒性获得了提高。7.转基因紫花苜蓿形态、产量、再生速度及品质方面研究显示,转基因株系与对照相比在形态上没有明显生长延缓、植株矮小等不良变化,只是叶片长度较对照植株稍短;在产量和再生速度上,转基因各株系有的高于对照,有的低于对照,T11和T9株系在产量及再生速度上均显著高于对照和其他株系；营养成分转基因株系均表现出高于对照的粗蛋白含量,营养品质有所提高。综合研究结果,T9和T11株系为表现最优的转基因株系。