大豆多肽具有多种功能特性和生理活性,在食品、医药、保健、日用化工等领域显示出较好的开发应用前景,但是生产过程中伴生的苦味制约了其进一步发展,近年来,去除大豆多肽苦味,提升其利用价值的报道相继出现,其中酶法脱苦具有较好的效果,至今仍旧是研究热点。本实验以发芽大豆为原料,提取纯化出一种蛋白酶,评价其脱苦功能,并对脱苦产物进行研究,不仅具有理论价值,而且为风味良好、抗氧化活性较高的大豆多肽的研发和生产提供了新的蛋白酶品种,能够很好的解决目前大豆多肽生产中的脱苦问题。本论文首先对发芽大豆基本营养物质的变化进行测定,根据发芽大豆蛋白酶活力、SDS-PAGE凝胶电泳变化趋势,最终确定选取发芽第6天大豆,用于提取具有脱苦功能的豆芽蛋白酶,并通过单因素优化实验得出,发芽6 d大豆蛋白酶的最佳提取液为NaCl溶液,最佳提取浓度为0.3 mol/L,最佳提取方式为两次浸提;蛋白酶酶解反应最佳条件为:反应时间3 h,反应温度50℃,反应体系pH值5.5。发芽6 d大豆蛋白酶粗提液经硫酸铵分级沉淀得到不同饱和度的九个盐析蛋白酶组分,选取饱和度为40%、50%、60%三个酶活较高组分(酶活力分别为0.17±0.01 U/mg、0.21±0.02 U/mg、0.45±0.05 U/mg)进行脱苦研究。采用分步酶解法,先用碱性蛋白酶酶解大豆分离蛋白得到苦味肽,再分别以酶活力较高的三组蛋白酶组分继续酶解。苦味评价显示:40%、50%、60%三个饱和度组分的豆芽蛋白酶均有较好的脱苦效果,其中50%盐析组分效果最佳,3 h后,大豆苦肽的苦味被完全除去。对于脱苦效果最好的豆芽蛋白酶组分进行分离纯化,经过DEAE-Sepharose FF阴离子柱、Sephadex G-100凝胶柱层析后得到两种产物G1、G2。其中G1具有极好的脱苦效果,该蛋白酶经过各步骤分离纯化后,酶活为2.67±0.1 U/mg,提纯倍数为20.54。对活性组分G1的平均分子量进行鉴定,HPGPC图谱显示在保留时间7.212有一个对称尖峰,8.579处有一个对称峰,两个峰值所占的面积分别为57.34%和42.66%,分析本研究所得纯化产物G1主要由两种蛋白酶组成,分子量分别为64.57 ku和25.12 ku,其平均分子量为47.74 ku。圆二色谱、红外光谱对纯化产物G1进行结构鉴定,结果显示G1的二级结构以β-折叠和无规则卷曲为主(其中α-螺旋含量为16.36%,β-折叠含量为36.44%,β-转角含量为16.36%,无规则卷曲含量为30.85%)。本研究同时对豆芽蛋白酶脱苦产物的理化性质及抗氧化活性进行了研究,结果表明,比起底物大豆苦肽(碱性蛋白酶酶解大豆分离蛋白的产物苦味多肽),其水解产物E(纯化活性产物G1水解大豆苦肽的脱苦产物)的水解度、可溶性肽得率、蛋白质回收率均相应增加,不但有利于提升产物活性,同时增加了产物的营养价值和对大豆蛋白的利用率;蛋白酶水解产物E的水解氨基酸、游离氨基酸组成发生了一系列的变化,其中水解产物E的平均疏水度值比碱性酶解苦味肽减少了约35.14 kJ/mol,苦味消失,同时,多肽E中游离氨基酸对应的平均疏水度值增加了约35.37 kJ/mol,说明经过脱苦酶解,对于苦味值贡献较大的疏水性氨基酸残基被蛋白酶大量切除,变成对于苦味影响不大的游离氨基酸,此时多肽E的苦味消失,这与苦味评价得到的结果一致;蛋白酶水解产物E对于DPPH·自由基、·OH自由基、O2-·自由基的清除能力比底物苦味肽显著升高,总还原能力显著增强。该研究为大豆多肽酶法脱苦提供了一种新型蛋白酶。