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种源鉴定（species identification）在食品药品安全和法医物证鉴定领域中有重要价值,其中常见哺乳动物检材鉴定问题发生最为频繁。然而常规方法,如普遍使用的DNA条形码技术,均不能解决混合检材、腐败降解检材等特殊检材的种源鉴定问题。本研究选取8个哺乳动物代表材料,设计了 12S rRNA和16S rRNA宏条形码,基于高通量测序技术,初步建立起一种基于Miseq高通量测序平台鉴定混合物种的方法。针对二代测序技术无法实现物种成分定量问题,论文探讨使用荧光定量PCR技术进行补充,为常见哺乳动物检材鉴定提供技术参考。种源鉴定研究结果如下:（1）使用12S rRNA和16S rRNA基因特有引物进行PCR扩增和Sanger测序,结果表明PCR扩增效率为100%;测序峰图干净无杂峰,测序成功率为100%。单独使用12S rRNA和16S rRNA测序序列经GenBank 比对,与数据库已有序列相似度均在98%以上,表明这两个标记均可准确鉴定种源信息。使用DNA条形码方法进行鉴定,序列在构建的邻接树上的物种分辨度为100%。（2）样本DNA等浓度混合后的混合样品稀释成不同梯度浓度（3 ng/μL、0.3ng/μL、0.03 ng/μL）,使用两对通用引物扩增后进行二代测序建库和基于Miseq平台的二代测序。经质控去除低质量序列,双端序列拼接后12S rRNA共获得196309条reads,其序列平均长度为391bp;16S rRNA共获得144952条reads,其序列平均长度为408bp。将获得的序列汇总在OTU中,目标物种在12S rRNA扩增样本中相对丰度占比最高为梅花鹿（Cervus nippon）29.49%,最低为人（Homo sapiens）3.18%。在 16S rRNA 扩增样本中相对丰度占比最高为梅花鹿（Cervus nippon）26.47%,最低为小家鼠（Mus musculus）0.82%。而混合样品的各物种的浓度比例均相同,说明二代测序在种源物种成分定量分析存在局限。在非目标物种中,相对丰度占比最高为12S rRNA的黇鹿（Dama dama）0.1055%和16S rRNA的加拿大马鹿（Cervus canadensis）0.01281%。采用MP进行系统发育树的构建,发现非目标物种与目标亲缘关系较近,推测为序列库比对错误的结果。为此在本方法中,可将样品检测灵敏度的阈值设为0.5%,以减少非目标物种对种属鉴定的影响,这样可使二代测序检测方法的鉴定结果更为可靠。（3）采用实时荧光定量PCR方法测定检材DNA浓度的下限,以测定12S rRNA和16S rRNA通用引物的灵敏性。研究表明,各样本在浓度梯度下（1 ng/μL、0.1 ng/μL、0.01 ng/μL、0.001ng/μL）的Ct值均小于35,而人和鼠的样本在1pg/μL的12S rRNA扩增结果中,人和鼠的平均Ct值为35.872和36.759;在1pg/μL的16S rRNA扩增结果中人和鼠的平均Ct值为35.209和35.177,均大于35。其余样本Ct值在0.1pg/μL浓度下大于35。说明本研究中该引物的通用检测阈值在0.001ng/μL。针对二代测序技术中样本序列相对丰度与实际含量不能建立比例关系问题,本研究对二代测序物种中单一样品对应浓度的扩增曲线进行分析,发现6个物种可以通过扩增曲线进行荧光定量,但在同样浓度下人和鼠的样本扩增效率不如其他物种,与二代测序结果中人和鼠的相对丰度最低一致,推测二代测序中物种的相对丰度与引物扩增效率有关。综上所述,研究针对线粒体12S rRNA和16S rRNA基因区段设计通用宏条形码引物,采用Sanger测序、Miseq高通量测序和荧光定量PCR技术评估两对高通量测序分子标记的有效性,初步建立了一种基于Miseq高通量测序平台鉴定混合物种的方法,并针对二代测序技术无法实现样本成分定量问题补充荧光定量PCR技术进行分析。因此本研究开发的鉴定方法可为常见哺乳动物检材鉴定提供技术参考。