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目的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌)是我国常见的恶性肿瘤之一,起病隐匿、病程短、死亡率高。HCC的发生发展的分子机制复杂且尚未完全清楚,相关研究发现miRNA参与HCC生物学行为,促进HCC的发生发展。本研究前期通过公共数据库筛选肝癌差异表达的miR-1266及其靶基因ATG7,在人群肝癌组织中验证miR-1266、ATG7,在HepG2细胞株中构建miR-1266过表达和抑制表达,探讨miR-1266对肝癌细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等生物学行为的影响。为肝癌的早期诊断和靶向治疗提供理论依据。方法1.生物信息学分析:(1)下载TCGA数据库(the Cancer Genome Atlas)肝癌基因表达数据,筛选差异表达miRNA,再经检索文献,选择尚未在肝细胞癌中报道且参与肿瘤相关生物学功能的miR-1266作为本研究的候选基因;(2)应用miRNA靶基因预测网站(TargetScan、RNA22、miRwalk、miRtarbase)预测miR-1266的候选靶基因,再利用TCGA数据库分析miR-1266和候选mRNA的相关性,将负相关的作为miR-1266的候选靶基因。经文献检索,本研究选择ATG7作为miR-1266候选靶基因进行研究;(3)下载TCGA数据库的肝癌患者临床信息数据,分析miR-1266和肝癌患者临床病理特征关系,并采用Kaplan-Meier法分析miR-1266对肝癌预后的影响。2.在人群肝癌组织中验证基因表达:收集广西医科大学附属肿瘤医院HCC患者的肝癌组织及配对癌旁组织60对,并收集患者的临床病理相关信息。实时荧光定量PCR方法检测肝癌组织及配对癌旁组织样本中miR-1266和ATG7的表达,分析miR-1266和ATG7的相关性及miR-1266、ATG7与临床病理特征的关系。3.在肝癌细胞株中验证基因表达:在上海中科院细胞所购买6株(BEL-7404、SK-HEP-1、SMCC-7721、Hep 3B、Huh7、HepG2)肝癌细胞株,用实时荧光定量PCR检测6株肝癌细胞株miR-1266表达。对HepG2细胞构建过表达和抑制表达体系,同时检测miR-1266和ATG7的表达。4.细胞功能实验:对HepG2细胞构建过表达和抑制表达体系,进行细胞增殖实验、细胞周期实验、细胞凋亡实验,探讨miR-1266对肝癌细胞Hep G2生物学行为的影响。结果1.生物信息学分析显示:(1)TCGA数据库共提供377个HCC患者的数据,平均年龄59岁,其中209例临床数据与基因表达数据完整且匹配。对377例肝癌组织和50例癌旁组织进行测序,50例癌旁组织均来源于377例肝癌组织。(2)共筛出98个差异的miRNA,其中27个上调,71个下调,基于文献检索后,选择尚未在肝细胞癌中报道且参与肿瘤相关功能的miR-1266作为本研究的候选基因。(3)4个miRNA靶基因预测网站取交集共筛出60个mRNA,其中GRINA、PCSK2、RAB15、PTDSS2、EIF5AL1、MUTYH、ATG7与miR-1266呈负相关(P<0.05),经文献检索,本研究选择ATG7作为miR-1266的候选靶基因。(4)miR-1266与临床病理特征的关系:miR-1266的表达水平与肿瘤分级、甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)、年龄分布差异有统计学意义(P<0.05),而性别、家族史、有无HBsAg感染、MVI(Microvascular invasion)、肿瘤状态、T分期及生存状态分布差异无统计学意义(P>0.05)。(5)Kaplan-Meier法分析显示,miR-1266表达水平与HCC生存时间无统计学关联(P>0.05)。2.人群肝癌样本基因表达分析结果显示:(1)miR-1266在肝癌组织中的表达水平高于癌旁组织(t=3.402,P=0.001),ATG7在肝癌组织中的表达水平低于癌旁组织(t=-2.44,P=0.019);(2)miR-1266在肝癌组织中与ATG7呈负相关(r=-0.324,P=0.023);(3)miR-1266的表达水平在肿瘤分化程度、甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)分布差异有统计学意义(P<0.05),而性别、年龄、职业、有无门脉高压、有无家族史、有无HBsAg感染、肿瘤大小、MVI(Microvascular invasion)、有无包膜侵犯、有无肝外转移、有无腹水、巴塞罗那(BCLC)分期、有无门脉癌栓等分布差异无统计学(P>0.05)。(4)ATG7的表达水平在肿瘤大小、巴塞罗那(BCLC)分期分布差异有统计学意义(P<0.05),而性别、年龄、职业、有无门脉高压、有无家族史、有无HBsAg感染、肿瘤分化程度、AFP、MVI(Microvascular invasion)、有无包膜侵犯、有无肝外转移、有无腹水、有无门脉癌栓等分布差异无统计学意义(P>0.05)。3.肝癌细胞株基因表达分析结果显示:(1)miR-1266在BEL-7404、SK-HEP-1及SMCC-7721细胞中低表达,在Hep 3B、Huh7及HepG2细胞中表达较高。由于miR-1266在HepG2细胞中表达最高,因此,选择HepG2细胞进行后续的实验。(2)miR-1266过表达组中miR-1266表达丰度是阴性对照组的417.78倍,miR-1266抑制表达组中miR-1266表达丰度是阴性对照组的0.79倍。(3)过表达miR-1266,ATG7表达下降(P<0.05),而抑制表达miR-1266,ATG7的表达变化差异无统计学意义(P>0.05)。4.细胞功能实验:(1)CCK8细胞增殖实验结果显示:miR-1266过表达组细胞增殖能力增强(P<0.05),而miR-1266抑制表达组的增值能力被抑制(P<0.05)。(2)细胞周期实验结果显示:miR-1266过表达组处于S期的细胞增多(P<0.05),处于G1期的细胞无显著变化(P>0.05),处于G2/M期的细胞减少(P<0.05);miR-1266抑制表达组处于G1期、S期的细胞无显著变化(P>0.05),处于G2/M期的细胞增多(P<0.05)。(3)细胞凋亡实验结果显示:miR-1266过表达组对肝癌细胞的凋亡能力高于对照组(P<0.05),但实际凋亡率变化不明显;miR-1266抑制表达组对肝癌细胞的凋亡能力无影响(P>0.05)。结论1.miR-1266在肝癌组织中表达上调,ATG7在肝癌组织中表达下调;2.miR-1266、ATG7与肝癌临床病理特征相关;3.miR-1266在肝癌组织和HepG2细胞中的表达水平与ATG7呈负相关;4.miR-1266过表达和抑制表达影响肝细胞癌的增值、细胞周期,提示miR-1266可能通过调控ATG7的表达促进肝癌的生物学行为。