岩藻糖基转移酶(fucosyltransferases,FUTs),是一类参与岩藻化寡糖合成的关键酶,研究表明 LeY,sLex和 Lex等岩藻化寡糖的阶段特异性表达在胚胎发育和着床过程起十分重要的作用。因此,对岩藻糖基转移酶表达的分析和研究不仅有助于探讨寡糖在着床过程中的作用机制,并为对着床过程进行干预提供了新的思路和手段。 选择适当的,高灵敏度的检测方法是基因表达定量分析的关键,本文通过琼脂糖凝胶电泳,微流控芯片,荧光定量 PCR 等定量方法的比较,选择 Real-Time PCR 对小鼠受孕早期胚胎、子宫内膜 FUT2 基因和胚胎 FUTs(FUT1, FUT4, FUT7, FUT8,FUT9)基因表达进行定量分析。 白血病抑制因子(LIF)是一类具有广泛生物学功能的分泌型糖蛋白,已被证实是胚胎着床必需的重要细胞因子,已知其对着床网络中的多种因子(如基质金属蛋白酶 MMPs,表皮生长因子 EGF 等)均有调节作用,但其对岩藻糖基转移酶的调控机理尚不清楚。本文主要研究了LIF 因子对 FUT7 的影响作用。 本论文的具体方法和结果如下: (一)收集小鼠未孕及孕 D4 天子宫内膜,应用 RT-PCR 技术进行2FUT2 基因和内参 GAPDH 基因的扩增,对不同循环数的 PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳和微流控芯片技术检测,同时应用 Real-Time PCR技术对上述基因进行分析,并比较三种方法的灵敏度和最低检测限度。结果显示,FUT2 基因琼脂糖凝胶电泳可检测最低限度为 25 个循环的PCR 扩增产物,而 20 个循环扩增的产物无法检测到;微流控芯片技术可以检测到稀释 5 倍的经 20 个循环扩增的 PCR 产物,其灵敏度提高 103倍。Real-Time PCR 有较高灵敏度和特异性,对于单胚胎的基因扩增可在 18.88 个循环检测到产物,并可实时监测,准确定量,在重复性和稳定性有明显优势。(二)应用 Real-Time PCR 技术对小鼠受孕不同天数子宫内膜和不同发育时期单个胚胎 FUT2 基因的表达进行定量分析,并改进了单胚胎基因定量分析方法。结果表明,Real-Time PCR 方法可以准确的对目的基因进行定量,灵敏度高,对 2-cell 期的单个胚胎的基因表达即可进行检测。 FUT2 基因在受孕子宫内膜和胚胎均有表达,但孕 D4 天子宫内膜和胚胎都有降低趋势,子宫内膜拷贝数约从 1011降至 1010个,胚胎拷贝数约从 108降至 107个。结果尚提示 FUT2 基因可能与着床前胚胎的发育成熟及子宫内膜接受态的建立有关,但具体机制尚不清楚,其基因表达量的改变为进一步开展其功能研究提供了一定的实验依据。(三)对小鼠不同发育时期单个胚胎表达 FUT 基因家族(FUT1,FUT4, FUT7, FUT8,FUT9)进行 Real-Time PCR 定量分析。结果显示:在发育不同时期 FUT1 基因, FUT4 基因 和 FUT7 基因的表达逐渐升高,到桑椹期达到高峰并持续至囊胚期;FUT8 基因在各发育时期的表达相对稳定,无明显变化趋势;FUT9 基因在 8-cell 高表达,桑椹期和囊胚期开始降低。FUT 基因家族各时期表达量及变化趋势各不相同,但却和各自合成的相关寡糖抗原变化趋势一致,提示对 FUT 基因选择性调控可以影响相映寡糖的合成和表达,由此影响胚胎的发育。(四)应用 PCR、间接免疫荧光以及 Dot-blot 等分析方法分别研究了 LIF 因子对体外培养胚胎和子宫内膜细胞 FUT7 基因表达和酶蛋白分泌以及胚胎培养液中其产物 sLeX寡糖分泌的影响。胚胎和细胞分别在含 LIF 因子(0.1,1,10,100ng/ml)或 LIF-Ab (3μg/ml)的培养