第一部分胆汁淤积症患儿肠道微生态学变化与肝功能指标的相关性研究目的:观察胆汁淤积症患儿肠道微生态学变化,力图发现特征性菌群变化规律;阐明胆汁淤积症患儿肠道微生态学变化与肝脏功能指标的相关关系;寻找婴儿胆汁淤积症(Infantile Cholestatic,IC)潜在肠道菌群(Gut Microbiota,GM)的生物标志物。方法:自2017年1月至2018年1月,收集住院患儿符合纳入标准的胆汁淤积症婴儿及门诊健康查体的婴儿,分为健康对照组(H组,n=37例)和婴儿胆汁淤积症组(IC组,n=43例),收集其性别、年龄(月)、分娩方式、喂养方式、临床诊断等信息,同时检测肝脏功能,并收集粪便通过16sr DNA分析GM构成,分析GM与肝脏功能指标的相关性,采用随机森林模型筛选、验证生物标志物,用PICRUST预测肠道菌群功能。结果:1.检测43例胆汁淤积症患儿和37例健康婴儿的肠道菌群构成。2.所有样本以双歧杆菌属、类杆菌属、肠球菌属、布劳特氏菌属、罗斯氏菌属和粪便杆菌属为主。IC组GM多样性显著低于H组(P=0.013)。喂养方式对H组、IC组间的GM差异有影响(P=0.009)。3.IC、H两组GM在属水平上丰度前10的属中,有13个存在丰度差异,包括双歧杆菌属、拟杆菌属、链球菌属、肠球菌属和葡萄球菌属。IC组GM的共存网络更复杂,叶状杆菌属、瘤胃球菌属和厌氧菌属是IC组共存网络中的核心节点。采用随机森林模型分析,确定了罗斯氏菌属、Eggerthella、叶状杆菌属和布劳特氏菌属,可作为生物标记物高准确度区分IC患儿和健康婴儿(AUC>0.97)。4.利用京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)注释发现,IC患儿中与脂质代谢、外源性生物降解和代谢以及各种疾病相关的功能类别增多,IC患儿与氨基酸代谢和维生素代谢相关的功能类别减少。5.GM组成与肝功能指标之间存在显著相关性,巨球型菌属与总胆红素、间接胆红素呈正相关;γ-GGT与Parasutterella呈正相关,与链球菌属呈负相关。第二部分ANIT诱导亚急性胆汁淤积模型大鼠肠道微生态变化目的:胆汁淤积性肝病病因复杂,多为慢性疾病过程,第一部分的临床研究表明,胆汁淤积肝病患儿发生特征性肠道微生态变化,本实验研究目的是:观察亚急性胆汁淤积SD模型大鼠肠道菌群的特征性构成是否贯穿整个疾病过程?亚急性胆汁淤积SD模型大鼠肠道菌群的特征性变化在疾病的发生发展过程中是因?是果?及可能机制?探索胆汁淤积前后及疾病进展过程中肠道菌群变化与临床相关指标如肝功能和肝脏纤维化指标的关联性。方法:将试验的SD大鼠随机分为2组:正常对照组(N组,n=8只)和亚急性胆汁淤积模型组(M组,n=28只)。M组大鼠在造模的第1天、第7天、第14天、第21天时分别给予α-萘异硫氰酸酯(α-Naphthylisothiocyanate,ANIT)(75mg/kg)灌胃1次制作亚急性胆汁淤积模型,N组大鼠正常进食水。于造模的第3天、第9天?第16天和第23天时,M组分别处死7只大鼠,N组分别处死2只大鼠。采血检测肝功能丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate Aminotransferase,AST)、总胆红素(Total Bilirubin,TBIL)、间接胆红素(Direct Bilirubin,DBIL)、胆汁酸(Total Bile Acids,TBA)、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ–glutamyltranspeptidase,γ–GT)及肝纤维化指标透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)、III型前胶原(Procollagen III,PCIII)、IV型胶原(Collagen IV,c IV)、层粘连蛋白(Laminin,LN);采集肝脏组织行HE染色,观察肝脏病理,同时留取粪便,采用16sr DNA分析肠道菌群组成。结果:1.在造模第3天、第9天、第16天和第23天时M组大鼠肝脏功能和肝纤维化指标(HA)明显高于N组,肝脏病理均呈现胆汁淤积表现。2.M组大鼠肠道菌群丰度、物种多样性与N组比较没有统计学差异,但两组大鼠肠道菌群物种构成存在差异。在门水平上,M组大鼠肠道菌群以拟杆菌门为主,N组以厚壁菌门为主。在属水平上,造模第9天时,M组大鼠粪便菌群中双歧杆菌属、乳杆菌属、瘤胃球菌属丰度明显低于N组(P<0.05);Parabacteroides及普氏菌属明显高于N组(P<0.05);造模第23天时M组大鼠粪便菌群中双歧杆菌属、乳杆菌属、丰度明显低于N组(P<0.05),Parabacteroides明显高于N组(P<0.05)。LEf Se分析:双歧杆菌属、瘤胃球菌属、普氏菌属存在统计学差异。3.双歧杆菌属、乳杆菌属与ALP、AST、ALT、TBA均成负相关;瘤胃球菌属与TBA及ALP成负相关;Parabacteroides与TBIL、TBA、ALP、AST、ALT成正相关,普氏菌属与TBA成正相关(P<0.05)。第三部分观察不同干预措施对ANIT诱导亚急性胆汁淤积模型大鼠的保肝利胆作用及肠道菌群变化的机制研究目的:基于“肠-肝轴”新的治疗理念被应用于胆汁淤积性肝病中,结合我们前期临床和基础实验结果,第三部分研究目的:1.观察不同干预措施对亚急性胆汁淤积模型大鼠的保肝利胆效果;2.探索不同干预措施对其肠道菌群的动态影响;3.对其相关机制进行研究。方法:将实验的SD大鼠随机分为5组:正常对照组(N组,n=16)、熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic,UDCA)干预组(A组,n=22)、鼠李糖乳杆菌GG(Lactbacillus rhamnosus GG,LGG)干预组(B组,n=22)、LGG+UDCA联合干预组(C组,n=22)、疾病观察组(M组,n=22)。基于第二部分亚急性胆汁淤积模型造模方法,对A、B、C、M组制作亚急性胆汁淤积模型。在造模第3天开始给予各组大鼠药物干预,即A组每日UDCA100mg/kg;B组每日灌服LGG 2.5ml,C组每日先灌服UDCA 100mg/kg、1小时再灌服LGG 2.5ml 1次/日;M组无额外干预措施,干预21天。分别于实施干预措施后的第1天、7天、14天、21天时各组处死大鼠4只,检测肝脏功能指标、肝纤维化指标,行肝脏病理,采用Western blot检测肝脏法尼酯X受体(Farnesoid X Receptor,FXR)蛋白、肝脏胆固醇7-羟化酶(cholesterol 7-alpha hydroxy-lase,CYP7A1)蛋白,回肠FXR蛋白及Na+依赖性胆酸盐转运蛋白(apical sodium-dependent bile acid transporter,ASBT)蛋白表达。在实施干预措施第7天和第21天时分别处死大鼠7只,采集肠内容物行16sr DNA分析肠道菌群组成。结果:1.UDCA干预对胆汁淤积模型大鼠肝脏功能指标影响不大;LGG干预能够降低肝脏功能各项指标(P<0.05),LGG与UDCA联合应用未呈现协同或拮抗作用;药物干预与时间没有交互效应。2.A、B、C、M组大鼠的肝脏纤维化指标透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)均明显高于N组(P<0.05)。UDCA与LGG对于肝纤维化指标影响没有交互效应(P>0.05)。药物干预第1周时,C组大鼠HA水平明显低于A、B、M组(P<0.05)。3.药物干预第1周、第2周、第3周时,A、B、C组大鼠肠ASBT蛋白表达量均低于M组(P<0.05),肠FXR蛋白表达量均高于M组(P<0.05),A、B组肝脏FXR蛋白表达量均高于M、C组(P<0.05);C组肝脏FXR蛋白表达量高于M组(P<0.05);药物干预第1周、第3周时,A、B、C组大鼠肝脏CYP7A1蛋白表达量均低于M组(P<0.05)。4.NMDS法分析A、B、C组粪便菌群构成相似度高,M与N组及药物干预组(A、B、C组)大鼠肠道菌群构成存在可比性。各时间点、各组肠道菌群物种多样性差异不显著(P>0.05)。N组大鼠肠道菌群中以厚壁菌门、放线菌门为主;A、B、C、M组大鼠在药物干预第7天、第23天时,以拟杆菌门为主;A、B、M组大鼠放线菌门丰度明显低于N组(P<0.05),C组放线菌门明显高于A、B组(P<0.05)。在药物干预第7天时,A、B、M组大鼠肠道双歧杆菌属丰度明显低于N组(P<0.05),B、C组双歧杆菌属丰度明显高于A、M组(P<0.05)。在药物干预第23天时,B组双歧杆菌属丰度高于A、C、M组。5.线性相关性分析发现:双歧杆菌属与ALP、AST、ALT、TBA成负相关(P<0.05);乳杆菌属与ALP成负相关(P<0.05),瘤胃球菌属与AST、ALT及ALP成负相关(P<0.05),Parabacteroides与TBIL、TBA、ALP、AST、ALT成正相关(P<0.05)。结论:1.IC患儿与健康婴儿肠道菌群存在差异,细菌群落多样性降低,菌群共存网络复杂,叶状杆菌、瘤胃球菌和厌氧菌是共存网络中核心节点。罗斯氏菌属、Eggerthella、叶状杆菌属和布劳特氏菌属可作为高准确度区分IC患儿和健康婴儿的生物标记物。肠道微生态组成与肝功能指标间存在关联。2.成功制作了亚急性胆汁淤积大鼠模型,与临床胆汁淤积性肝病的病理过程相吻合,满足临床观察肝脏损害指标和肠道微生态学变化需求。3.亚急性胆汁淤积模型大鼠胆汁淤积前后及进展过程中存在肠道微生态学动态改变,这种胆汁淤积后的肠道特征性菌属变化是一种适应性改变,随时间推移,菌群结构也趋于稳态。4.胆汁淤积模型大鼠早期肠道中双歧杆菌属、瘤胃球菌属减少和普氏菌属比例变化是早期胆汁淤积的特征性生物标志。5.胆汁淤积模型大鼠肠道双歧杆菌属、乳杆菌属及Parabacteroides与肝脏功能变化存在关联。6.LGG能够改善胆汁淤积模型大鼠肝脏各项指标,在疾病早期能降低肝纤维化指标HA。7.LGG通过直接或间接促进肝脏和回肠FXR蛋白表达,抑制肝CYP7A1蛋白表达,抑制胆汁酸产生;抑制肠ASBT蛋白表达,减少胆汁酸重吸收,减轻胆汁淤积和降低胆汁酸对肝脏进一步损伤,同时间接降低HA。8.LGG通过改善肠道生境扶正菌群结构,减轻肠道菌群失衡,发挥对肝脏的保护作用。9.因本研究观察时间和样本数量限制,未发现UDCA对ANIT诱导的胆汁淤积大鼠的保护肝脏作用和对肠道微生物群的影响。10.UDCA联合LGG应用对胆汁淤积模型鼠的肝脏功能、肝纤维化指标未产生协同或拮抗作用,需大样本研究加以证实。