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副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种重要的食源性致病菌，在海产品中污染严重，食物中毒后会导致急性胃肠炎。传统生理生化鉴定方法步骤繁琐，耗时费力，不能快速检测出副溶血性弧菌。因此，建立一种快速、准确、高效检测副溶血性弧菌的方法显得至关重要。
本研究建立了实时荧光单引物等温扩增(Real-time fluorescence single primer isothermal amplification，RF-SPIA)技术检测副溶血性弧菌的方法。该方法可通过荧光曲线法、荧光可视法和沉淀可视法判定扩增结果，避免了繁琐的凝胶电泳过程。
本研究根据副溶血性弧菌的toxR基因设计引物，建立了RF-SPIA检测副溶血性弧菌的反应体系和反应条件。其反应体系共25μL，包括:dNTPs(0.25mM)，2×Bca DNA聚合酶缓冲液（2.0μL），5×RNase H酶缓冲液(2.5μL)，MgSO4(0.9mM)，核糖核酸抑制剂(24U)，牛血清白蛋白(0.8mg/mL)，链终止多聚核苷酸(blocker)（0.48μM），DNA/RNA杂合引物（1.4μM），模板(1.0μL)，SYBR GreenⅡ（0.8μL，1∶399稀释），Bca DNA聚合酶(19.8U)，RNase H酶(36U)，RNase-free water补足体系。其反应条件:94℃预变性80s，然后加入Bca DNA聚合酶和RNase H酶，61℃孵育30min～60min，可根据扩增情况随时终止反应。
选取41株菌株对RF-SPIA引物的特异性进行验证。结果显示，12株副溶血性弧菌均为阳性结果，29株非副溶血性弧菌均为阴性结果。因此，该RF-SPIA引物具有高度特异性。
分别对副溶血性弧菌的纯培养物及人工污染生牡蛎样品进行检测，确定RF-SPIA的灵敏度和检出限。结果显示，RF-SPIA方法检测副溶血性弧菌纯培养物的荧光曲线法和荧光可视法的灵敏度均为5.7×100CFU/mL，沉淀可视法的灵敏度为5.7×101CFU/mL，传统PCR方法的灵敏度为5.7×102CFU/mL。RF-SPIA方法检测人工污染生牡蛎样品中副溶血性弧菌的荧光曲线法和荧光可视法的检出限均为4.2×101CFU/g，沉淀可视法检的检出限4.2×102CFU/g，传统PCR方法的检出限为4.2×103CFU/g。由此可见，RF-SPIA荧光曲线法和荧光可视法的灵敏度及检出限是传统PCR方法的100倍，RF-SPIA沉淀可视法的灵敏度及检出限是传统PCR方法的10倍。RF-SPIA荧光曲线法和荧光可视法的灵敏度及检出限是沉淀可视法的10倍。因此，与传统PCR方法相比，RF-SPIA检测副溶血性弧菌的方法具有明显的优势。
本研究分别采用国家标准方法(GB4789.7-2013)和RF-SPIA方法对241份海产品样品进行检测，确定RF-SPIA方法的敏感性、特异性及符合率。结果显示，GB4789.7-2013的阳性样品数为129份，RF-SPIA的阳性样品数为131份。RF-SPIA方法的敏感性为100％，特异性为98.21％，符合率为99.17％。
本研究建立的RF-SPIA方法具有操作简便、反应时间短、灵敏度高等优点。因此，RF-SPlA方法更适合于基层检测机构的应用与推广。
本研究建立了实时荧光单引物等温扩增(Real-time fluorescence single primer isothermal amplification，RF-SPIA)技术检测副溶血性弧菌的方法。该方法可通过荧光曲线法、荧光可视法和沉淀可视法判定扩增结果，避免了繁琐的凝胶电泳过程。
本研究根据副溶血性弧菌的toxR基因设计引物，建立了RF-SPIA检测副溶血性弧菌的反应体系和反应条件。其反应体系共25μL，包括:dNTPs(0.25mM)，2×Bca DNA聚合酶缓冲液（2.0μL），5×RNase H酶缓冲液(2.5μL)，MgSO4(0.9mM)，核糖核酸抑制剂(24U)，牛血清白蛋白(0.8mg/mL)，链终止多聚核苷酸(blocker)（0.48μM），DNA/RNA杂合引物（1.4μM），模板(1.0μL)，SYBR GreenⅡ（0.8μL，1∶399稀释），Bca DNA聚合酶(19.8U)，RNase H酶(36U)，RNase-free water补足体系。其反应条件:94℃预变性80s，然后加入Bca DNA聚合酶和RNase H酶，61℃孵育30min～60min，可根据扩增情况随时终止反应。
选取41株菌株对RF-SPIA引物的特异性进行验证。结果显示，12株副溶血性弧菌均为阳性结果，29株非副溶血性弧菌均为阴性结果。因此，该RF-SPIA引物具有高度特异性。
分别对副溶血性弧菌的纯培养物及人工污染生牡蛎样品进行检测，确定RF-SPIA的灵敏度和检出限。结果显示，RF-SPIA方法检测副溶血性弧菌纯培养物的荧光曲线法和荧光可视法的灵敏度均为5.7×100CFU/mL，沉淀可视法的灵敏度为5.7×101CFU/mL，传统PCR方法的灵敏度为5.7×102CFU/mL。RF-SPIA方法检测人工污染生牡蛎样品中副溶血性弧菌的荧光曲线法和荧光可视法的检出限均为4.2×101CFU/g，沉淀可视法检的检出限4.2×102CFU/g，传统PCR方法的检出限为4.2×103CFU/g。由此可见，RF-SPIA荧光曲线法和荧光可视法的灵敏度及检出限是传统PCR方法的100倍，RF-SPIA沉淀可视法的灵敏度及检出限是传统PCR方法的10倍。RF-SPIA荧光曲线法和荧光可视法的灵敏度及检出限是沉淀可视法的10倍。因此，与传统PCR方法相比，RF-SPIA检测副溶血性弧菌的方法具有明显的优势。
本研究分别采用国家标准方法(GB4789.7-2013)和RF-SPIA方法对241份海产品样品进行检测，确定RF-SPIA方法的敏感性、特异性及符合率。结果显示，GB4789.7-2013的阳性样品数为129份，RF-SPIA的阳性样品数为131份。RF-SPIA方法的敏感性为100％，特异性为98.21％，符合率为99.17％。
本研究建立的RF-SPIA方法具有操作简便、反应时间短、灵敏度高等优点。因此，RF-SPlA方法更适合于基层检测机构的应用与推广。